Este video muestra todo inmunohistoquímica montaje, un método por el cual el patrón de expresión espacial y temporal de un antígeno puede ser visualizado en embriones de pollo joven. Este método fue introducido originalmente por Jane Dodd y Tom Jessell.
Abstract
El embrión de pollo es una herramienta valiosa en el estudio del desarrollo embrionario temprano. Su transparencia, accesibilidad y facilidad de manipulación, lo convierten en una herramienta ideal para estudiar la expresión de anticuerpos en el desarrollo del cerebro, del tubo neural y somitas. Este video muestra las diferentes etapas de la tinción de anticuerpos todo el montaje con HRP secundaria anticuerpos conjugados, En primer lugar, el embrión se diseca del huevo y se fijaron en paraformaldehído. Peroxidasa en segundo lugar, endógena se inactiva, el embrión se expone a anticuerpo primario. Después de varios lavados, el embrión se incuba con el anticuerpo secundario conjugado con HRP. Actividad de la peroxidasa se reveló mediante la reacción con el sustrato diaminobencidina. Finalmente, el embrión se fija y se procesaron para la fotografía y el corte. La ventaja de este método sobre el uso de anticuerpos fluorescentes es que los embriones pueden ser procesados por el corte de cera, lo que permite el estudio de los sitios de antígeno en la sección transversal. Este método fue introducido originalmente por Jane Dodd y Tom Jessell<sup> 1</sup>.
Protocol
I. Esquema general: Este video muestra las diferentes etapas de inmunohistoquímica montar todo en embrión de pollo. En primer lugar, el embrión se fija en PFA [IHC1]. Entonces, la actividad peroxidasa endógena se apaga [IHC2]. El embrión se incuba en la primaria de anticuerpos [IHC3]. Después de varios lavados, el embrión se incuba en la secundaria de anticuerpos [IHC4], la reacción de color se revela con DAB [IHC5] y la tinción de anticuerpos parece naranja [IHC6]. <p class="jove…
Discussion
Este video muestra los diferentes pasos en la realización de todo el montaje la tinción de anticuerpos en embriones de pollo joven. Este protocolo se utiliza esencialmente para la caracterización espacial y temporal de nuevos anticuerpos en el pollito 2,3, así como para el uso de los marcadores antigénicos conocidos para determinar malformación embrionaria después de insultar 4.
Acknowledgements
Los anticuerpos monoclonales (15.3B9, PAX7) desarrollado por (J. Dodd, TM Jessell y Kawakami A.) se obtuvieron de los Estudios del Desarrollo del Banco hibridoma desarrollado bajo los auspicios del NICHD y mantenido por la Universidad de Iowa, Departamento de Ciencias Biológicas , Iowa. DP es receptor de Ruth Premio Kirschstein DA021977 1F32-01A1 del Instituto Nacional sobre Abuso de Drogas. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Margaret M. Alkek a RHF.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Eggs
Charles River Laboratories
Premium Fertile
Fertilized, HH4 (16 hr)
Stereomicroscope
Microscope
Leica Microsystems
MZ9.5 or similar
Marsh Automatic Incubator
기타
Lyon
RX
Curved Forceps (1)
Tool
Electron Microscopy Sciences
72991-4C
Forceps (2)
Tool
Fine Science Tools
11002-13
Fine scissors
Tool
Fine Science Tools
14161-10
Plastic dishes
Tool
Falcon
353001
Rubber Bulb
Tool
Electron Microscopy Sciences
70980
Pasteur Capillary Pipette
Tool
Electron Microscopy Sciences
70950-12
round edge under flame
Microdissecting knife
Tool
Fine Science Tools
10056-12
Use to cut embryo from surrounding membranes following fixation
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base
Reagent
Dow Corning
0001986475
Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
16% PFA
Reagent
Electron Microscopy Sciences
15710
30% H2O2
Reagent
Sigma
H1009
BSA
Reagent
Sigma
A3803
NGS
Reagent
Jackson Immuno
005-000-121
Primary Antibodies
Reagent
Developmental studies Hybridoma Bank
4G11, 15.3B9, PAX7
For these antibodies, investgators used mouse donnors
Peroxidase conjugated-Goat Anti-Mouse IgG (H+L)
Reagent
Jackson Immuno
115-035-003
3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride
Reagent
Pierce
34001
Store at -20; Allow bottle to warm to RT before use.