Summary

Metod för hela berget antikropp färgning i Chick

Published: February 02, 2009
doi:

Summary

Denna video visar hela montera immunohistokemi, en metod som den rumsliga och tidsmässiga uttryck mönster av ett antigen kan visualiseras i unga kycklingembryon. Denna metod introducerades ursprungligen av Jane Dodd och Tom Jessell.

Abstract

Den kycklingembryo är ett värdefullt verktyg i studiet av tidiga embryonala utvecklingen. Dess öppenhet, tillgänglighet och enkel manipulation, gör det ett idealiskt verktyg för att studera antikroppar uttryck i att utveckla hjärnan, neuralrörsdefekter och somit. Denna video visar de olika stegen i hela montera antikropp färgning med HRP konjugerade sekundära antikroppar, det första är embryot skäras ut från ägget och fasta i paraformaldehyd. För det andra, endogen peroxidas är inaktiverat, Embryot är då utsätts för primär antikropp. Efter flera tvättar, är embryot inkuberas med sekundär antikropp konjugerad med HRP. Peroxidasaktivitet avslöjas med hjälp av reaktion med Diaminobenzidin substrat. Slutligen är embryot fast och behandlas för fotografering och sektionering. Fördelen med denna metod över användningen av fluorescerande antikroppar är att embryon kan behandlas för vax sektionering, vilket gör det möjligt att studera antigen platser i genomskärning. Denna metod introducerades ursprungligen av Jane Dodd och Tom Jessell<sup> 1</sup>.

Protocol

I. Schematisk översikt: Denna video visar de olika stegen i hela montera immunohistokemi i kycklingembryo. För det första är embryot fastställs i PFA [IHC1]. Då är endogen peroxidasaktivitet kylda [IHC2]. Embryot är då inkuberas i primära antikroppen [IHC3]. Efter flera tvättar, är embryot inkuberas i sekundär antikropp [IHC4]; färgreaktion avslöjas med hjälp av DAB [IHC5] och antikroppar färgning visas Orange [IHC6]. <img src="/files/ftp_upload/old…

Discussion

Denna video visar de olika stegen för att utföra hela montering antikroppar färgning hos unga kycklingembryon. Detta protokoll är i huvudsak använts för den rumsliga och tidsmässiga karakterisering av nya antikroppar i chick 2,3, liksom för användningen av kända antigen markörer för att bestämma embryonala missbildningar efter förolämpning 4.

Acknowledgements

Den monoklonala antikroppar (15.3B9, PAX7) som utvecklats av (J. Dodd, TM Jessell och A. Kawakami) erhölls från utvecklingsstudier Hybridoma Bank utvecklats under ledning av NICHD underhålls och av University of Iowa, Institutionen för bio-vetenskaper , Iowa. DP är mottagare av Ruth Kirschstein Award 1F32 DA021977-01A1 från National Institute on Drug Abuse. Detta arbete stöddes av Margaret M. Alkek Foundation för att RHF.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Eggs   Charles River Laboratories Premium Fertile Fertilized, HH4 (16 hr)
Stereomicroscope Microscope Leica Microsystems MZ9.5 or similar  
Marsh Automatic Incubator 기타 Lyon RX  
Curved Forceps (1) Tool Electron Microscopy Sciences 72991-4C  
Forceps (2) Tool Fine Science Tools 11002-13  
Fine scissors Tool Fine Science Tools 14161-10  
Plastic dishes Tool Falcon 353001  
Rubber Bulb Tool Electron Microscopy Sciences 70980  
Pasteur Capillary Pipette Tool Electron Microscopy Sciences 70950-12 round edge under flame
Microdissecting knife Tool Fine Science Tools 10056-12 Use to cut embryo from surrounding membranes following fixation
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base Reagent Dow Corning 0001986475 Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
16% PFA Reagent Electron Microscopy Sciences 15710  
30% H2O2 Reagent Sigma H1009  
BSA Reagent Sigma A3803  
NGS Reagent Jackson Immuno 005-000-121  
Primary Antibodies Reagent Developmental studies Hybridoma Bank 4G11, 15.3B9, PAX7 For these antibodies, investgators used mouse donnors
Peroxidase conjugated-Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Reagent Jackson Immuno 115-035-003  
3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride Reagent Pierce 34001 Store at -20; Allow bottle to warm to RT before use.
Cedar wood oil Reagent Sigma W522503  
Fast green FCF Reagent Sigma F7252  
Minuten pins 0.2mm diam   Fine Science Tools 26002-20  

References

  1. Yamada, T., Placzek, M., Tanaka, H., Dodd, J., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the developing nervous system: Polarizing activity of the floor plate and notochord. Cell. 64, 635-647 (1991).
  2. Streit, A., Stern, C. D., Thery, C., Ireland, G. W., Aparicio, S., Sharpe, M. J., Gherardi, E. A role for HGF/SF in neural induction and its expression in Hensen’s node during gastrulation. Development. 121, 813-824 (1995).
  3. Basch, M., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. Specification of neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).
  4. Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen’s node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
check_url/kr/956?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Psychoyos, D., Finnell, R. Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick. J. Vis. Exp. (24), e956, doi:10.3791/956 (2009).

View Video