Denna video visar hela montera immunohistokemi, en metod som den rumsliga och tidsmässiga uttryck mönster av ett antigen kan visualiseras i unga kycklingembryon. Denna metod introducerades ursprungligen av Jane Dodd och Tom Jessell.
Abstract
Den kycklingembryo är ett värdefullt verktyg i studiet av tidiga embryonala utvecklingen. Dess öppenhet, tillgänglighet och enkel manipulation, gör det ett idealiskt verktyg för att studera antikroppar uttryck i att utveckla hjärnan, neuralrörsdefekter och somit. Denna video visar de olika stegen i hela montera antikropp färgning med HRP konjugerade sekundära antikroppar, det första är embryot skäras ut från ägget och fasta i paraformaldehyd. För det andra, endogen peroxidas är inaktiverat, Embryot är då utsätts för primär antikropp. Efter flera tvättar, är embryot inkuberas med sekundär antikropp konjugerad med HRP. Peroxidasaktivitet avslöjas med hjälp av reaktion med Diaminobenzidin substrat. Slutligen är embryot fast och behandlas för fotografering och sektionering. Fördelen med denna metod över användningen av fluorescerande antikroppar är att embryon kan behandlas för vax sektionering, vilket gör det möjligt att studera antigen platser i genomskärning. Denna metod introducerades ursprungligen av Jane Dodd och Tom Jessell<sup> 1</sup>.
Protocol
I. Schematisk översikt: Denna video visar de olika stegen i hela montera immunohistokemi i kycklingembryo. För det första är embryot fastställs i PFA [IHC1]. Då är endogen peroxidasaktivitet kylda [IHC2]. Embryot är då inkuberas i primära antikroppen [IHC3]. Efter flera tvättar, är embryot inkuberas i sekundär antikropp [IHC4]; färgreaktion avslöjas med hjälp av DAB [IHC5] och antikroppar färgning visas Orange [IHC6]. <img src="/files/ftp_upload/old…
Discussion
Denna video visar de olika stegen för att utföra hela montering antikroppar färgning hos unga kycklingembryon. Detta protokoll är i huvudsak använts för den rumsliga och tidsmässiga karakterisering av nya antikroppar i chick 2,3, liksom för användningen av kända antigen markörer för att bestämma embryonala missbildningar efter förolämpning 4.
Acknowledgements
Den monoklonala antikroppar (15.3B9, PAX7) som utvecklats av (J. Dodd, TM Jessell och A. Kawakami) erhölls från utvecklingsstudier Hybridoma Bank utvecklats under ledning av NICHD underhålls och av University of Iowa, Institutionen för bio-vetenskaper , Iowa. DP är mottagare av Ruth Kirschstein Award 1F32 DA021977-01A1 från National Institute on Drug Abuse. Detta arbete stöddes av Margaret M. Alkek Foundation för att RHF.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Eggs
Charles River Laboratories
Premium Fertile
Fertilized, HH4 (16 hr)
Stereomicroscope
Microscope
Leica Microsystems
MZ9.5 or similar
Marsh Automatic Incubator
기타
Lyon
RX
Curved Forceps (1)
Tool
Electron Microscopy Sciences
72991-4C
Forceps (2)
Tool
Fine Science Tools
11002-13
Fine scissors
Tool
Fine Science Tools
14161-10
Plastic dishes
Tool
Falcon
353001
Rubber Bulb
Tool
Electron Microscopy Sciences
70980
Pasteur Capillary Pipette
Tool
Electron Microscopy Sciences
70950-12
round edge under flame
Microdissecting knife
Tool
Fine Science Tools
10056-12
Use to cut embryo from surrounding membranes following fixation
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base
Reagent
Dow Corning
0001986475
Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
16% PFA
Reagent
Electron Microscopy Sciences
15710
30% H2O2
Reagent
Sigma
H1009
BSA
Reagent
Sigma
A3803
NGS
Reagent
Jackson Immuno
005-000-121
Primary Antibodies
Reagent
Developmental studies Hybridoma Bank
4G11, 15.3B9, PAX7
For these antibodies, investgators used mouse donnors
Peroxidase conjugated-Goat Anti-Mouse IgG (H+L)
Reagent
Jackson Immuno
115-035-003
3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride
Reagent
Pierce
34001
Store at -20; Allow bottle to warm to RT before use.