Pression de polissage Pipettes Amélioration patch-clamp

Summary

Ceci est un guide pour modifier la forme de micropipettes de verre. Plus précisément, en utilisant la chaleur et la pression d'air du cône est élargi sans pour autant augmenter l'ouverture astuce, conduisant à une plus faible résistance pipette. Cela est essentiel pour obtenir des enregistrements à faible bruit de petites cellules, mais est utile dans de nombreuses applications.

Abstract

Pression de polissage est une méthode pour façonner des pipettes en verre pour patch-clamp. Nous avons d'abord développé cette méthode pour la fabrication de pipettes approprié pour l'enregistrement de petite taille (<3 m) des corps cellulaires neuronaux. Le principe de base est similaire à soufflage du verre et combine la pression de l'air et la chaleur de modifier la forme de pipettes de patch préparé par un extracteur micropipette conventionnels. Il peut être appliqué aux soi-disant douces (chaux sodée) et durs (borosilicate) lunettes. De manière générale le polissage de pression, peut réduire la résistance pipette de 25% sans diminuer le diamètre de l'ouverture pointe (Goodman et Lockery, 2000). Il peut être appliqué à pratiquement n'importe quel type de verre et ne nécessite que l'ajout d'une vanne à haute pression et à équiper une microforge. Cette technique est indispensable pour l'enregistrement à partir des cellules ultrapetites (<5 m) et peut également améliorer canal unique d'enregistrement en minimisant la résistance pipette. La forme émoussée est également utile pour l'enregistrement de pince-patch perforé puisque cette forme de la pointe des résultats dans une bulle plus grande membrane disponible pour la perforation.

Protocol

Pipettes de traction En utilisant un filament extracteur comme une Sutter P-97 Extracteur microélectrodes Flaming / Brown, tirer un ensemble d'environ 10-20 pipettes. Sélectionnez votre verre. Nous utilisons borosilicate (BF150-86-10, DO = 1,5 mm, ID = 0,86 mm). Conservez le verre avec soin afin qu'il reste propre et sans poussière. Concevoir un programme de traction. L'objectif principal est une astuce ouverture d'environ la taille désirée, ce qui dépendra de l'appl…

Discussion

Nous avions d'abord développé cette méthode pour faire des pipettes utile pour patch-clamp 2-3 um neurones en C. elegans ^1. C'est dans l'utilisation de routine dans le laboratoire de Goodman. Pipettes pression polonaise Nous avons non seulement pour l'enregistrement à partir de minuscules C. neurones elegans, mais aussi pour l'obtention d'enregistrements macropatch et un seul canal des canaux ioniques exprimés dans des ovocytes de Xenopus. Pour une donnée pointe de l'ou…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Glass Capillaries	Consumable	Sutter Instruments	BF150-85-10 (or similar)	The method works with any type of capillary except those made from quartz. However, we recommend using capillaries with a filament.
Inverted Microscope	Microscope	Leica	DM IL (or similar)	Any simple inverted microscope will do. However, it is essential to have sufficient magnification to see pipettes during polishing. We use a 100x metallurgical lens with a long working distance for this purpose.
Microforge Kit	Tool	ALA Science	CPM-2	Supplies polishing coil, controller and foot pedal.
Air pressure source	Tool	ALA Science	PR-60	Accessory for providing high pressure, includes a suitable valve. Alternatively, compressed air from the building can be used together with a filter/regulator (set to 40 PSI) and a 4-way valve (see below)
4-way valve	Tool	Cole-Parmer	A-98150-01	Fittings will be needed to couple valve to tubing
Pipette Holder with Luer Connector	Tool	World Precision Instruments	MPH-6S20	Use a male luer-to-barb fitting to connect pipette holder to high-pressure tubing
Tygon® tubing	Tool	Cole-Parmer	06408-62	Use this tubing to connect pipette holder to 4-way valve