Name: Murine Renal Transplantation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-10T00:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 48 s
Description: Lernen Sie die Nierentransplantation bei Mäusen für die Transplantationsbiologie. Diese Methode zeigt chirurgische Techniken, postoperative Betreuung und die Überwachung der Transplantatfunktion durch Kreatininmessungen.

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Diese Studien wurden zum Teil finanziert durch den NIH R01 AI36532 zu GAH unterstützt. Wir möchten die hervorragende Unterstützung in der Transplantationsmedizin Pathologie von Dr. Tibor Nadasdy vorgesehen anerkennen, und die wertvolle Anleitung und Weitsicht von dem verstorbenen Dr. Charles G. Orosz bei der Initiierung dieser Forschungsanstrengungen zur Verfügung gestellt.

Spenderorgan Ernte (2): <ol><li> Anesthetize des Spenders mit 65mg/kg Pentobarbital IP; Anästhesie wird durch Isofluran (2-3%) erhalten. </li><li> Machen Sie einen Medianschnitt vom Brustbein bis zum Schambein zum Spender Bauch geben und setzen die linke Niere, indem der Darm seitlich an der rechten Seite. </li><li> Isolieren Sie die linke Niere durch Unterbindung und Teilen der Nebennieren und Hoden-Schiffe mit einer 8-0 Seidenfaden. </li><li> Mobilisieren der Aorta oberhalb seiner Einmündung in die A. und V. renalis. </li><li> Mobilisieren Sie die untere Hohlvene (IVC) oberhalb und unterhalb der Kreuzung mit der renalen Arterie und Vene. </li><li> Ligieren der Aorta unterhalb der Nieren-Arterie und Vene mit einer 8-0 Seidenfaden, um Blutungen zu minimieren. </li><li> Präparieren Sie die linke Ureter aus dem Nierenhilus in die Blase. </li><li> Setzen Sie die ureterovesical Kreuzung mit kaudaler Einfahren auf die Blase Kuppel. </li><li> Excise eine kleine, elliptische Patch der Blase mit der linken ureterovesical Kreuzung für Harn-Rekonstruktion über eine Blase zu Blase Anastomose verwendet. Der rechte Ureter ist nicht mit der Blase enthalten. </li><li> Ligieren des IVC unterhalb der Nieren-Arterie und Vene mit einer 8-0 Seidenfaden. </li><li> Ligieren der Aorta oberhalb der Nierenarterie und Vene, und langsam perfuse das Transplantat in situ mit 0,2-0.4ml Kälte, heparinisierten Ringer-Laktat-Lösung über das infrarenalen Aorta. </li><li> Ligieren des IVC oberhalb der A. und V. renalis mit einem 8-0 Seidenfaden. </li><li> Transect der Nierenvene bei ihrem Zusammentreffen mit der IVC. </li><li> Teilen Sie die Aorta schräg, etwa 2mm unterhalb der Nierenarterie. </li><li> Entfernen der Niere und ihrer Gefäßversorgung mit Harnleiter an die Blase Patch en bloc. Shop in Lactat-Lösung Ringer auf dem Eis. </li><li> Euthanize des Spenders Maus durch Genickbruch unter Narkose. </li></ol> Empfänger Transplantation (2): <ol><li> Anesthetize der Empfänger mit 65 mg / kg Pentobarbital IP und Aufrechterhaltung der Narkose durch Isofluran (2-3%). </li><li> Machen Sie eine Mittellinienschnitt decken den Darm mit nassen Gaze und vorsichtig zieht es zur linken Seite. </li><li> Ligieren des rechten Ureters, Nieren-Arterie und Vene, und entfernen Sie die rechte Niere. </li><li> Sorgfältig zu isolieren und cross-clamp der infrarenalen Aorta und IVC mit zwei 4-mm microvasular Schellen nach Ligation der Lendenwirbelsäule Filialen. </li><li> Legen Sie eine 10-0 Nylonfaden durch eine vollständige Dicke der Aorta und zurückziehen, um eine elliptische aortaotomy durch einen einzigen Schnitt (etwa ein Fünftel des Durchmessers des Schiffes) zu machen. </li><li> Machen Sie eine longitudinale Venotomie durch Einstechen in die IVC mit einer 30-Gauge-Nadel und erweitern entsprechend mit Mikroschere. </li><li> Spülen sowohl die Aorta und IVC mit heparinisierten Kochsalzlösung auf intraluminale Blut oder Blutgerinnsel klar. </li><li> Entfernen Sie die Spenderniere aus dem Eis und legen Sie sie intraabdominell in die rechte Flanke der Maus. Die Spenderniere wird feucht gehalten mit einem kalten Kochsalzlösung getränkten Gaze-Pad. </li><li> Legen Sie zwei Haltefäden am proximalen und distalen Spitze der Empfänger aortaotomy mit den Gebern Aorten-Manschette. </li><li> Machen Sie eine Ende-zu-Seit-Anastomose zwischen Spender Aorten-Manschette und die vordere Wand der Empfänger aortaotomy, mit 2 bis 3 kontinuierlich 10-0 Nylon Nähte in der Außenseite der Aorta. </li><li> Schalten Sie die Spenderniere Transplantat an der linken Flanke des Empfängers. Wiederholen Sie den vorherigen Verfahren zwischen den Donor-Aorten-Manschette und der hinteren Wand der Empfänger aortaotomy </li><li> Führen Sie eine Ende-zu-Seit-Anastomose zwischen Spender Nierenvene und die hintere Wand der Empfänger IVC, mit 4 bis 5 kontinuierlich 10-0 Nylon Nähte in der Innenseite des IVC. und dann die vordere Wand der IVC und Spendern Nierenvene mit 4 ~ 5 kontinuierliche Nähte außerhalb des IVC geschlossen. </li><li> Die Anastomose der beiden Vene und Arterie müssen innerhalb von 20 Minuten abgeschlossen sein. </li><li> Spülen Sie das Transplantat mit kalter Kochsalzlösung mehrmals Anastomose. </li><li> Teilen Sie die Kuppel des Empfängers Blase und Blutungen stoppen mit Kauter. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt an der Kuppel. </li><li> Legen Sie zwei Haltefäden von 10-0 Nylon an die Spender kleine Blase Patch mit den Empfängern Blase Kuppel anastomize. Jede Seite der Anastomose wird mit 8 ~ 10 ständige Stiche genäht. </li><li> Schließen Sie den Bauch in zwei Schichten mit kontinuierlicher 4-0 sterile, synthetischen resorbierbaren Vicryl Naht. </li><li> Geben Empfängermäuse 0.4ml warmen Kochsalzlösung während der Operation durch intermittierende Injektion IV. </li></ol> Post-operative Betreuung der Empfänger <ol><li> Nach dem Schließen der Bauch, ist eine einmalige intramuskuläre Injektion von Penicillin (500U/10g) verabreicht (2). </li><li> Darüber hinaus erhalten die Empfänger 0,05 mg / kg Buprenorphin intramuskulär am Tag 0 und Tag 1 nach der Operation zur Schmerzlinderung. Nach der Operation erhalten Transplantationspatienten Wasser mit sulfatrim (100mg/kg), bis das Experiment terminated. </li><li> Für die ersten 24 Stunden postoperativ Mäuse sind in einem temperierten Brutschrank gehalten. </li><li> Mäuse in der Regel aus der Narkose innerhalb von 1 Stunde der Operation erholen und erhalten regelmäßig Futter und Wasser ad libitum. </li><li> Hautnähte sind 2 Wochen nach der Operation entfernt. </li></ol> Empfänger Nephrektomie <ol><li> Anesthetize der Empfänger 4 ~ 7 Tage nach einer Nierentransplantation mit 65 mg / kg Pentobarbital IP; Anästhesie wird durch Isofluran (2-3%) erhalten. </li><li> Öffnen Sie den Bauch über eine Inzision in der Mittellinie. </li><li> Bedecken Sie den Darm mit Kochsalzlösung getränkten Gaze und vorsichtig zieht es zur rechten Seite. </li><li> Entfernen Sie die linke Niere nach Unterbindung der linken Harnleiter-, Nieren-Vene und Arterie. </li><li> Schließen Sie den Bauch in zwei Schichten mit kontinuierlicher 4-0 synthetischen resorbierbaren Vicryl Naht. </li></ol> Vollblut Kreatinin-Messungen <ol><li> -Bis zweiwöchigen Blutentnahme von weniger als 0,2 cc ist entweder submandibularly ohne Narkose oder retroorbital unter Isofluran-Narkose durchgeführt. </li><li> Quantitative ganze Blutkreatininspiegel werden mit Hilfe eines I-Stat Tragbare Clinical Analyzer (Heska Corp, Fort Collins, CO). </li><li> Konventionelle Einheiten (mg / dl) sind in SI-Einheiten von Mikromol / L durch Multiplikation des herkömmlichen Geräten um 88,4 umgewandelt. </li></ol>

<ol><li>Russell, P. S., Chase, C. M., Colvin, R. B., Plate, J. M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+transplants+in+mice.+An+analysis+of+the+immune+status+of+mice+bearing+long-term%2C+H-2+incompatible+transplants%5BTitle%5D)+AND+%22JExpMed%22%5BJournal%5D)">Kidney transplants in mice. An analysis of the immune status of mice bearing long-term, H-2 incompatible transplants.</a> JExpMed. 147, 1449-1468 (1978).</li>
<li>Zhang, Z., Schlachta, C., Duff, J., Stiller, C., Grant, D., Zhong, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+techniques+for+kidney+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Improved techniques for kidney transplantation in mice.</a> Microsurgery. 16 (2), 103-109 (1995).</li>
</ol>

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von der Ohio State University IACUC gesetzt durchgeführt.

Wir haben rund 1200 Fälle von Nierentransplantation bei Mäusen mit einer technischen Erfolgsrate von&gt; 90% durchgeführt. Im Vergleich zur Herztransplantation ist die Erfolgsrate von Nierentransplantationen in der Regel gering. Allerdings hat unser Labor eine hohe Erfolgsrate (&gt; 90%) von Nieren-Transplantation erhalten. Die wichtigsten Punkte für den Erfolg sind bis zur Reperfusion Verletzungen an beiden Spenderniere und Empfänger zu reduzieren und zu minimieren Blutungen und Thrombosen während des gesamten Verfahre...

<table><tbody><tr><td>i-STAT</td><td>Sonstiges</td><td>HESKA</td><td>Cat 5101</td><td></td></tr><tr><td>i-STAT-Kartusche</td><td>Sonstiges</td><td>HESKA</td><td>CAT 5110-CREA</td><td></td></tr><tr><td>Sulfatrim</td><td>Sonstiges</td><td>Actavis</td><td>R02109</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Sonstiges</td><td>NOVAPLUS</td><td>CA-0474</td><td></td></tr><tr><td>10-0 Nahtmaterial</td><td>Chirurgie</td><td>Sharpoint</td><td>AK0100</td><td></td></tr></tbody></table>

murine renal transplantation

Murine Renal Transplantation Procedure

Renal orthotopen Transplantation bei Mäusen ist eine technisch anspruchsvolle Verfahren. Obwohl die erste Nierentransplantation in Mäuse wurden durch Russell et al vor über 30 Jahren (1) durchgeführt und verfeinert von Zhang et al Jahre später (2) haben nur wenige Menschen in der Welt dieses Verfahren beherrschen. In unserem Labor haben wir erfolgreich 1200 orthotopen Nierentransplantation mit&gt; 90% Überlebensrate durchgeführt. Die wichtigsten Punkte für den Erfolg sind strengere Kontrolle der Reperfusion, Blutungen und Thrombosen, sowohl während des Verfahrens und nach der Transplantation und die Verwendung von 10-0 anstelle von 11-0 Naht für Anastomosen. Post-operative Behandlung und Pflege des Empfängers ist extrem wichtig für den Erfolg und Einschätzung für eine Transplantation. Alle Nierentransplantats Empfänger erhalten Antibiotika in Form einer Injektion von Penicillin sofort nach der Transplantation und sulfatrim in das Trinkwasser ständig. Insgesamt Tiergesundheit ausgewertet wird täglich und Vollblut-Kreatinin-Analysen werden regelmäßig mit einem tragbaren I-STAT Maschine Organfunktion zu beurteilen durchgeführt.

Renal Transplantation bei Mäusen ist eine technisch anspruchsvolle Verfahren, dass eine sorgfältige postoperative Betreuung und Behandlung für den Erfolg benötigt.

Murine Renal Transplantation

Die renale orthotope Transplantation bei Mäusen ist ein technisch anspruchsvolles Verfahren. Obwohl die ersten Nierentransplantationen bei Mäusen von Russell durchgeführt wurden ...

Das Verfahren zur Nierentransplantation bei der Maus beginnt mit der Entnahme eines Spenderorgans, bei der die linke Niere von der Spendermaus entfernt und auf Eis gelagert wird. Die rechte Niere wird von der Empfängermaus entfernt, um Platz für die Spenderniere zu schaffen. Anschließend wird die Spenderniere vom Eis genommen und in die Empfängermaus transplantiert.Der Maus wird eine Erholungsphase von vier Tagen gewährt, bevor die verbleibende native Niere entfernt wird. Nach sieben Tagen werden die Kreatininwerte mithilfe eines I STAT tragbaren klinischen Analysators überwacht, um die Transplantatfunktion zu beurteilen. Hallo, ich bin Sarah Heimer aus dem Labor von Dr. Greg Hadley und der Abteilung für Transplantationschirurgie der Ohio State University.Heute werden wir Ihnen ein Verfahren zur Nierentransplantation bei der Maus zeigen. Die Nierentransplantationsoperation, die Sie heute sehen werden, wird von unserer erfahrenen Fachärztin für Neurochirurgie, Jing Wing, durchgeführt. Bitte verwenden Sie dieses Verfahren in unserem Labor, um die immunologischen Vorgänge der Transplantatabstoßung sowie Strategien zur Verhinderung einer Abstoßung zu untersuchen.Beginnen wir also. Um die Entnahme des Spenderorgans einzuleiten, wird ein Zwickgriff durchgeführt, um sicherzustellen, dass das Tier vollständig anästhesiert ist. Innerhalb eines sterilen Feldes und unter Verwendung sterilisierter Instrumente führen Sie einen medianen Schnitt am anästhesierten Maus von Sternum bis Schambein durch und legen die linke Niere frei, indem Sie den Darm seitlich nach rechts verlagern, um die Perfusionsentnahme der Spender-Niere vorzunehmen. Legen Sie TY-4-8-0-Seidennähte um die Aorta und die untere Hohlvene unterhalb und oberhalb der Nierenarterie und -vene an.Langsam in situ über die Aorta infrarenalis mit kalter, heparinisierten Ringer-Lactat-Lösung perfundieren. Die linke Niere isolieren, indem die Nebennieren- und Hodengefäße sowie einige Lendenäste mit einer 8-0-Seidennaht abgebunden und durchtrennt werden. Anschließend das Zusammenflussgebiet von Aorta und Vena cava inferior mit der linken Nierenarterie und -vene freilegen und vier 8-0-Seidennähte um Aorta und Vena cava inferior unterhalb und oberhalb der Nierenarterie und -vene anlegen.Um Blutungen zu minimieren, ligieren Sie zuerst die Aorta unterhalb des Nierengefäßes. Dann dissezieren Sie den linken Harnleiter vom Nierenhilus bis zur Harnblase frei. Exponieren Sie die Harnleiter-Blasen-Schleimhautverbindung unter Verwendung einer Koda-Retraktion am Blasendom.Unter sorgfältiger Vermeidung des rechten Ureters wird ein kleines, elliptisches Stück der Harnblase, das die linke Ureterovesikalverbindung enth&auml;lt, ausgeschnitten. Dieses St&uuml;ck wird f&uuml;r die harnableitende Rekonstruktion mittels einer Blasen-zu-Blasen-Anastomose verwendet. Anschlie&szlig;end wird die Aorta oberhalb der Nierenarterie und -vene ligiert.Langsam die Rafts in situ über die infrarenale Aorta mit kalter, heparinisierten Ringer-Lactat-Lösung perfundieren. Die Aorta schräg etwa zwei Millimeter unterhalb der Nierenarterie teilen. Schließlich die Niere zusammen mit ihrem Gefäßversorgungsgebiet und dem an das Blasenpatch angehefteten Harnleiter entfernen.Die Niere sollte bis zur Transplantation in den Wirtsempfänger in Ringer-Laktatlösung auf Eis aufbewahrt werden, und die Spendermaus sollte unter Anästhesie durch Halswirbelverrenkung euthanasiert werden. Wie zuvor gezeigt, wird die Transplantation beim Empfänger mit einem Zupinzeln begonnen, um sicherzustellen, dass das Tier vollständig anästhesiert ist. Um die Operation zu beginnen, führen Sie einen medianen Hautschnitt durch, bedecken Sie den Darm mit feuchter Gaze und ziehen Sie ihn vorsichtig nach links zurück.Um diese Nierentransplantation erfolgreich abzuschließen, muss eine Anastomose zwischen der aortalen Manschette des Spenders und der Aorta des Empfängers durchgeführt werden. Die renale Vene des Spenders wird mit der unteren Hohlvene des Empfängers verbunden und der Blasenpatch des Spenders mit der Blase des Empfängers ligiert. Die rechte Harnleiter-Nierenarterie und -vene.Entfernen Sie die Niere nach der Ligatur. Isolieren Sie die Lendenäste vorsichtig und klemmen Sie die infrarenale Aorta und die untere Hohlvene mit zwei mikrovaskulären Klammern mit einer Breite von vier Millimetern ab. Führen Sie einen 10-0-Nylon-Faden durch die volle Dicke der Aorta und ziehen Sie diese zur Seite, um durch einen einzigen Schnitt, der etwa ein Fünftel des Gefäßdurchmessers beträgt, eine ovale Aortotomie anzulegen.Als Nächstes wird eine longitudinale Venotomie durchgeführt, indem die untere Hohlvene mit einer 30-Gauge-Nadel durchstochen und mithilfe einer Mikroschere entsprechend erweitert wird. Spülen Sie sowohl die Aorta als auch die untere Hohlvene mit heparinisiertem Kochsalzlösung aus, um intraluminäres Blut oder Gerinnsel zu entfernen. Entnehmen Sie die Spender-Niere aus dem Eis und platzieren Sie sie in der rechten Flanke der Maus.Platzieren Sie zwei Halte-Nähte am proximalen und distalen Apex der Aortotomie des Empfängers mit der aortalen Manschette des Spenders. Führen Sie eine end-seitige Anastomose zwischen der aortalen Manschette des Spenders und der vorderen Wand der Aortotomie des Empfängers mit zwei bis drei kontinuierlichen 10-0-Nylon-Nähten an der Außenseite der Aorta durch. Drehen Sie danach das Nierentransplantat des Spenders zur linken Flanke des Empfängers um.Wiederholen Sie das vorherige Vorgehen zwischen dem aortalen Cuff des Spenders und der hinteren Wand der Aorta des Empfängers. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Anastomosierung von Vene und Arterie innerhalb von 20 Minuten abgeschlossen sein muss. Während der Anastomosierung sollte das Transplantat außerdem mehrmals mit kalter Kochsalzlösung gespült werden.Führen Sie eine end-seitige Anastomose zwischen der Nierengefäßvene des Spenders und der hinteren Wand der unteren Hohlvene des Empfängers mit vier bis fünf kontinuierlichen 10-0-Nylon-Nähten an der Innenseite der Vena cava inferior durch. Verschließen Sie die vordere Wand der Vena cava inferior und die Nierengefäßvene des Spenders mit vier bis fünf kontinuierlichen Nähten außerhalb der Vena cava inferior. Der nächste Schritt ist die Teilung des Blasendomes des Empfängers.Stoppen Sie die Blutung mit der elektrischen Koagulation. Sobald die Stabilisierung abgeschlossen ist, führen Sie einen kleinen Schnitt an der Blasenkuppel durch, setzen zwei Haltefäden aus 10-0-Nylon ein, um den kleinen Spenderblasenlappen mit der Empfänger-Blasenkuppel zu anastomosieren, und vernähen Sie jede Seite der Anastomose mit acht bis zehn kontinuierlichen Nähten. Schließen Sie den Bauch abschließend in zwei Schichten mit kontinuierlichen 4-0-Nähten aus steriler, synthetischer, resorbierbarer Vicryl-Nahtmaterial. Die postoperative Versorgung beginnt mit der Verabreichung einer einmaligen intramuskulären Injektion von Penicillin. Der Transplantatempfänger erhält außerdem am Tag null und Tag eins nach der Operation 0,05 Milligramm pro Kilogramm Buprenorphin intramuskulär zur Schmerzlinderung sowie einen kontinuierlichen Vorrat an Wasser, das Sulfa-Trim enthält. Die ersten 24 Stunden nach der Operation wird das Tier in einem temperaturgeregelten Inkubator gehalten.Hautnähte werden zwei Wochen nach der Operation entfernt. Die Entfernung der verbleibenden nativen Niere ist entscheidend, damit der Rückgang der Transplantatfunktion mittels Messung der Serumkreatininwerte überwacht werden kann. Sie wird typischerweise vier bis sieben Tage nach der initialen Transplantation der Spenderniere durchgeführt und umfasst die wesentlichen Arbeitsschritte, die bei der Entfernung der Niere aus der Spendermaus angewandt werden.Die Isofluran-Anästhesie wird verwendet, um das Wirtstier zu sedieren, damit Blutproben entnommen werden können. Die quantitativen Kreatininwerte im Vollblut aus der retroorbitalen Region dienen als Messgröße zur Beurteilung der Transplantatfunktion und werden mit einem tragbaren I-Stat-Klinikanalysator bestimmt. Konventionelle Einheiten werden in SI-Einheiten umgerechnet, indem die konventionellen Einheiten mit 88,4 multipliziert werden.Die Konzentration von Kreatinin wird in Mikromol pro Liter angegeben. Die Tiere erholen sich in der Regel zwei bis drei Stunden nach der Operation und zeigen nach der Entfernung der verbleibenden nativen Niere ein normales Mausverhalten. Das Überleben des Tieres hängt von der Nierenfunktion des Transplantats ab, die durch tägliche Untersuchungen der allgemeinen Gesundheit des Tieres und des Kreatininspiegels beurteilt werden kann.Bestimmung von Vollblut mit einem tragbaren i-STAT-Klinikanalysator als Referenz. Ein nicht-transplantiertes normales Mausmodell weist einen Kreatininspiegel nahe 20 Mikromolar auf. Eine Nierentransplantatdysfunktion wird angenommen, wenn die Maus Anzeichen einer Erkrankung zeigt und der Kreatininspiegel nahe 100 Mikromolar erhöht ist.Wir haben Ihnen soeben die Vorgehensweise für die Nierentransplantation bei der Maus gezeigt. Obwohl dieses Verfahren technisch anspruchsvoll ist, hatte unser Labor große Erfolge bei der Durchführung. Damit ist alles gesagt.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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