Name: Das Tor zum Gehirn: Die Biologie des Primas Eye (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-27T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Erfahren Sie die Präparation der Netzhaut bei nicht-menschlichen Primaten zur Untersuchung retinaler Strukturen. Diese Methode ermöglicht Einblicke in Entwicklung, Alterung und menschliche Netzhauterkrankungen.

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Die Autoren bedanken sich bei Ikiel Ptito für seine technische Unterstützung danken. Wir bedanken uns bei Frank Ervin, Roberta Palmour und das Personal des Behavioural Sciences Foundation Laboratories in St Kitts, West Indies, für ihre anhaltende Unterstützung unserer Primaten arbeiten.

Teil 1: Pre-Processing von Gewebe <ol><li> Tissue sollte gut mit Paraformaldehyd, Glutaraldehyd oder Formalin perfundiert werden. Dies kann durch Standard-transcardial Perfusion in der Regel verwendet, um andere Organe Ernte erreicht werden. Es wird empfohlen, dass kurz nach der Tötung der Augen mit Fixiermittel nur unter der Linse gespritzt werden und in Fixativ. </li><li> In der vorliegenden Studie das Thema war tief mit Ketaminhydrochlorid (10 mg / kg, im), mit einer Überdosis Natrium-Pentobarbital (25 mg / kg, iv) eingeschläfert sediert und perfundierten transkardial mit 0,1 M PBS, bis sie vollständig ausgeblutet. Dies wird durch eine 4% Paraformaldehyd-Lösung in PBS für 5 min (~ 1 Liter) folgten. </li></ol> Teil 2: Entfernung des Augapfels aus der Augenhöhle <ol><li> Für einen leichteren Zugang zu den Augapfel ist es empfehlenswert, entfernen Sie zunächst das Gehirn. Sobald das Gehirn entfernt wurde das dünnwandige Umlaufbahn Knochen ist leicht ersichtlich. Verwenden Sie die Knochen Rongeure langsam Chip entfernt die Wand der Augenhöhle. Schneiden Sie die Augenmuskeln mit einem Skalpell entfernen und das Bindegewebe aus dem Augapfel. Schneiden Sie vorsichtig den Sehnerv, kann diese in elektronischer Mikroskopie Studien verwendet werden. Der Augapfel wird jetzt aus der Augenhöhle freigegeben werden. </li></ol> Teil 3: Präparieren der Netzhaut von der Augenmuschel <ol><li> Legen Sie das Auge in eine Petrischale mit PBS auf die Netzhaut vor dem Austrocknen bewahren. Ein Binokular oder Tisch montiert Vergrößerungslampe Stand befindet sich in der Sektion nützlich, aber nicht eine Notwendigkeit. Entfernen der Hornhaut, indem die Lederhaut in engem Zusammenhang mit dem Umfang der Hornhaut auf der Ebene der Ora serrata mit einem Paar Frühling Schere und entfernen Sie das Objektiv mit der Zange. </li><li> Verwenden Sie einen Pinsel, Pinzette, Schere und Feder auf der Netzhaut von der Lederhaut zu entfernen. Dies ist durch die Trennung der Netzhaut von der Lederhaut und dann schneiden die Lederhaut weg mit der Schere gemacht. Man muss diesen Prozess auszuführen in kleinen Schritten, um nicht zu beschädigen oder zu reißen Netzhautgewebe. Die Sklera ist nicht ohne weiteres aus dem Rest des Sehnervs getrennt, so sorgfältig geschnitten der Lederhaut um den Sehnerv. </li><li> An diesem Punkt der Netzhaut hat ihre gebogene Form erhalten und muss für die Probenahme abgeflacht werden. Vor Abflachung der Netzhaut kann der Glaskörper, der die Konsistenz von Gelee hat, in einem Klumpen zu entfernen. Zum Reduzieren der Netzhaut auf eine Folie, um mehrere radiale Schnitte mit einem Skalpell. Die restlichen Glaskörper können nun mit gewöhnlichen Filterpapier und einem Pinsel entfernt werden. Die retinalen Ganglienzellen ist an dieser Stelle ausgesetzt so ist es unerlässlich, sanft zu sein, wenn das Entfernen des Glaskörpers ist. Wenn der Sehnerv ist noch in der Papille angebracht sind, entfernen den Sehnerv ohne zu reißen der Netzhaut mit einem Skalpell und ein Paar Frühling Schere. Dies ist nun eine flache Montage Netzhaut (Abbildung 1) und der Fovea sollte so ein dunkler Fleck in der zeitlichen / ventral von der Papille sichtbar. </li></ol> Teil 4: Probenahme <ol><li> Es gibt eine Reihe von Optionen zum Abtasten der Netzhaut. Hier beschreiben wir die Flatmount Vorbereitung und isodentric Probenahme. Für beide Verfahren Flatmount der Netzhaut mit den Glasfaser-Schicht von der Folie. Wenn die Absicht besteht, den retinalen Ganglienzellen in der Flatmount Vorbereitung zu untersuchen, ist es notwendig, entweder zu entfernen oder Bleichmittel das Pigmentepithel. So entfernen Sie das Pigmentepithel mit einem Pinsel leicht, einen Teil dieser Schicht zu entfernen, führt dies tendenziell zu den Photorezeptorschicht Schäden. Bleaching beinhaltet Einweichen der Netzhaut in Kaliumpermanganatlösung (0,25%) für 1 Stunde, Waschen in destilliertem Wasser, und das Clearing in Oxalsäure (5%) für 5 Minuten. 2 </li><li> Wenn die Absicht besteht, Zell-und Morphologie der einzelnen Schichten über die Netzhaut zu untersuchen, dann empfehlen wir isometrische Abtastung der Netzhaut. Die Netzhaut sollten auf einer Folie flatmounted und feucht gehalten mit PBS. Für isometrische Probenahme schneiden kleine Stücke von Gewebe gleich weit entfernt von der Papille in der Nase, zeitliche, oberen und unteren Richtungen (Abbildung 1). Es ist nicht notwendig zu bleichen das Pigmentepithel in dieser Zubereitung. Diese Stücke können jetzt in der koronalen Ebene geschnitten mit einem Kryostaten, Vibratom oder Ultramikrotom je nach Fragestellung. Für Kryostat Schnitte, sollten die Stücke in 30% Saccharose Nacht cryoprotected und eingefroren in Zusammenhang mit einem Eindeckmedium auf Trockeneis. Alternativ können die Proben in Agar eingebettet werden und in Scheiben geschnitten auf einem Vibratom. Der Kryostat und Vibratom Präparate zuverlässig Ertrag Abschnitte so dünn wie 4 m. Wenn dünner Schnitte erforderlich sind (z. B. für Elektronenmikroskop Vorbereitung), ist es notwendig, die Proben für die Ultramikrotom vorzubereiten. Um dies zu tun, sollten die Abschnitte werden post-fixed in Osmiumtetroxid für 1 Stunde unter dem Abzug durchzuführen. Dies wird durch Dehydrierung in einem abgestuften Ethanol-Reihe (50, 70, 95, 95, 100, 100%) und 100% Propylenoxid gefolgt. Das Gewebewird dann in Epon (Embed-812 Einbettung Kit) eingebettet. </li></ol> Teil 5: Repräsentative Ergebnisse: In unserem Labor haben wir routinemäßig Immunhistochemie auf kryogeschnitten retinae (Abb. 2). In diesem Fall sind wir in der isodensity von Cannabinoid-Rezeptoren (CB1) in der Netzhaut von Primaten interessieren. Wir untersuchen auch die Auswirkungen der pränatalen Ethanol-Exposition auf die Primaten visuellen Systems. Zu diesem Zweck sind wir daran interessiert, Zelldichte und Schichtdicke in der Fovea und in der peripheren Netzhaut. Um dies zu erreichen, betten wir Stücke von Netzhaut in Epon, Slice bei 700nm auf einem Ultramikrotom und Fleck mit 1% Toluidinblau (Abbildung 3). <img src="/files/ftp_upload/1261/fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1 Flatmount Retina. Radial Schnitte werden verwendet, um die Netzhaut zu glätten. <img src="/files/ftp_upload/1261/fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2 Immunfärbung. Gefrier der peripheren Netzhaut immungefärbt für CB1, wo die retinalen Ganglienzellen stark mit einigen Kennzeichnung in der inneren und äußeren nuklearen Schichten gekennzeichnet sind. Die Dicke dieser Abschnitt ist 14 m und gefärbt auf der Folie. RG - retinalen Ganglienzellen Schicht; IP - inneren plexiformen Schicht; IN - innere Körnerschicht; OP - plexiformen Schicht; ON - äußere Körnerschicht. <img src="/files/ftp_upload/1261/fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3 Fovea. Schnitt durch die Fovea, die in Epon eingebettet war und in Scheiben geschnitten auf einem ultramicrotrome bei 700nm. Die Photorezeptorschicht (PR) wurde verwendet, um die Abschnitte auszurichten. Beachten Sie, dass das gesamte Ausmaß der Photorezeptoren identifiziert werden können zeigt einen geeigneten Winkel in der Frontalebene werden. Dichte-Messungen wurden bei 300 m, 500 m und 800 m vom Zentrum der Fovea Grube mit dem Bioquant Imaging-System übernommen. RG - retinalen Ganglienzellen Schicht; IP - inneren plexiformen Schicht; IN - innere Körnerschicht; OP - plexiformen Schicht; ON - äußere Körnerschicht; Balken = 50 m

<ol><li>Hendrickson, A., Kupfer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histogenesis+of+the+fovea+in+the+macaque+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">The histogenesis of the fovea in the macaque monkey.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 15, 746-756 (1976).</li>
<li>Herbin, M., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+and+distribution+of+retinal+ganglion+cells+in+the+St.+Kitts+green+monkey+%28Cercopithecus+aethiops+sabeus%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Size and distribution of retinal ganglion cells in the St. Kitts green monkey (Cercopithecus aethiops sabeus).</a> J Comp Neurol. 383, 459-472 (1997).</li>
<li>Stone, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStone%2C+J+%22The+Wholemount+Handbook%22">The Wholemount Handbook</a>. , Maitland Publishing Pty. Ltd. Sydney. (1981).</li>
<li>Herbin, M., Boire, D., Theoret, H., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transneuronal+degeneration+of+retinal+ganglion+cells+in+early+hemispherectomized+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Transneuronal degeneration of retinal ganglion cells in early hemispherectomized monkeys.</a> Neuroreport. 10, 1447-1452 (1999).</li>
<li>Krebs, W., Krebs, I. Primate Retina and Choroid Atlas of Fine Structure in Man and Monkey. , Springer-Verlag. New York. (1991).</li>
<li>Pow, D., Sullivan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+kinesis%2C+neurite+sprouting+and+abnormal+axonal+projections+of+cone+photoreceptors+in+the+aged+and+AMD-afflicted+human+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Nuclear kinesis, neurite sprouting and abnormal axonal projections of cone photoreceptors in the aged and AMD-afflicted human retina.</a> Exp Eye Res. 84, 850-857 (2007).</li>
</ol>

Die Vorbereitung der Netzhaut als wholemount ermöglicht die Analyse der Topographie und räumliche Verteilung der entweder die Ganglienzellschicht oder den Endothelzellen der retinalen Gefäße 3. Die Quantifizierung der Zelldichte in der Peripherie der Netzhaut von Primaten ist leicht erreicht. jedoch in perifovealen und fovealen Regionen, behindert das Stapeln mehrerer Schichten in den Ganglienzellen Quantifizierung. Um dies zu umgehen potenzielle Verzerrung kann der Fovea und perifovealen Region aus der whole...

<table><tbody><tr><td>Skalpell</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellklingen</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Federscheren</td><td>Fine Science Tools</td><td>15020-15</td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td>Jede chirurgische Schere ist ausreichend</td></tr><tr><td>Rongeuren</td><td>Fine Science Tools</td><td>16121-14</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-924-150</td><td></td></tr><tr><td>Kamel- oder Marderhaarpinsel</td><td>Jeder Anbieter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

das tor zum gehirn: die biologie des primas eye

The Gateway to the Brain: Dissecting the Primate Eye

Das visuelle System des Menschen gilt als das Tor zur Welt und spielt eine Hauptrolle in der Fülle der sensorischen, perzeptiven und kognitiven Prozessen. Es ist daher nicht verwunderlich, dass die Qualität der Vision zur Verbesserung der Lebensqualität verbunden ist. Trotz der weit verbreiteten klinischen und der Grundlagenforschung über die Ursachen von Sehstörungen, fehlt es in vielen Formen von Sehbehinderungen, wie Retinitis pigmentosa und Makuladegeneration, wirksame Behandlungen. Nicht-menschliche Primaten haben die engste allgemeine Merkmale der Entwicklung des Auges zu der des Menschen. Nicht nur haben sie eine ähnliche vaskuläre Anatomie, aber unter anderen Säugetieren, haben Primaten die einzigartige Eigenschaft, die eine Region in der zeitlichen Netzhaut für eine hohe Sehschärfe, die Fovea spezialisiert<sup&gt; 1</sup&gt;. Hier beschreiben wir eine allgemeine Technik zum Präparieren der Primas Netzhaut um Gewebe für Netzhaut-Histologie, Immunhistochemie, Laser-Mikrodissektion, sowie Licht-und Elektronenmikroskopie liefern. Mit dem erweiterten Einsatz der nicht-menschlichen Primaten als translationale Modell ist unsere Hoffnung, dass ein besseres Verständnis der Netzhaut wird Einblicke in effektive Ansätze zur Abschwächung oder Umkehr der negativen Auswirkungen von Sehstörungen auf die Lebensqualität der betroffenen Personen liefern.

Die nicht-menschlichen Primaten ist ein wichtiger translationale Arten für unser Verständnis der Entwicklung und Alterung. Die anatomische Organisation des Primas Netzhaut kann wichtige Einblicke in normalen und pathologischen Bedingungen beim Menschen liefern.

Das Tor zum Gehirn: Die Biologie des Primas Eye

Das visuelle System beim Menschen gilt als das Tor zur Welt und spielt eine zentrale Rolle bei der Vielzahl sensorischer, perzeptiver und kognitiver ...

Dieses Verfahren beginnt mit einem gut perfundierten Affenkopf. Nach Entfernung des Gehirns werden die Augäpfel entnommen und verbunden. Nachdem das Gewebe entfernt wurde, werden die Hornhautlinse, die Sklera und das Glaskörperfluid sorgfältig abgetragen, wodurch die Netzhaut freigelegt wird.Die Netzhaut wird flach auf einen Objektträger gelegt, und das verbleibende Glaskörpermaterial wird entfernt. Anschließend werden Iso-Dentrix-Proben entnommen und kryoprotegiert. Hallo, ich bin Dr. Mark Burke vom Labor für Visuelle Neurowissenschaften am Institut für Optometrie der Universität Montreal.Hallo, ich bin Dr. Shaheen Zur, ebenfalls vom Labor für Visuelle Neurowissenschaften am Institut für Optometrie der Universität Montreal. Hallo, ich bin Dr. Tito, Leiter des Labors für Visuelle Neurowissenschaften am Institut für Optometrie der Universität Montreal. Heute werden wir Ihnen ein Verfahren zur Dissektion einer Netzhaut von nichtmenschlichen Primaten zeigen.Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um verschiedene Aspekte der Netzhautorganisation bei normaler Entwicklung sowie als Reaktion auf entwicklungsmäßige Störungen zu untersuchen. Beginnen wir also. Starten Sie dieses Pr

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die nicht-menschlichen Primaten ist ein wichtiger translationale Arten für unser Verständnis der normalen Verarbeitung des Gehirns. Die anatomische Organisation des Primas Gehirn kann wichtige Einblicke in normalen und pathologischen Bedingungen beim Menschen liefern.

Grundlagen zur nicht-menschlichen Primaten Brain in stereotaktischen Raum

Eine formale Demonstration der Zerlegung einer Maus Auge, was zu einem ganzen Berg der retinalen Pigmentepithels.

Präparation einer Maus Eye für einen ganzen Berg von retinalen Pigmentepithel

Diese Video-Präsentation zeigt ein Verfahren zur Ernte der beiden wichtigsten stark vaskuläre Strukturen, die Vorderhirn Funktion unterstützen. Sie sind die Hirnoberfläche (oberflächliche) Gefäßsystem zusammen mit den zugehörigen Hirnhäute (MAV) und der Plexus, die notwendig für die zerebrale Durchblutung und Liquor (CSF) Homöostase sind.

Ein Visual Beschreibung der Dissektion der Hirnoberfläche Gefäßsystem und assoziierten Hirnhäute und der Aderhaut Plexus aus Rattenhirn

Dieses Video beschreibt, wie man das erwachsene Drosophila-Gehirn präpariert und isoliert – ein Verfahren, das notwendig ist, um das Organ sichtbar zu machen, das sonst von der Nagelhaut, dem Auge und dem Luftröhrengewebe verdeckt wird. Das Beispielprotokoll zeigt eine detaillierte Demonstration, die zu hochwertigen Präparaten führt, die für Immunfärbungen und bildgebende Verfahren in der Neurobiologie von Drosophila verwendet werden können.

Drosophila Dissektion des Gehirns von Erwachsenen: Eine Methode der Fliegenneurobiologie

Dieses Video beschreibt, wie man den Auge-Hirn-Komplex aus Drosophila-Puppen präpariert und isoliert. Das vorgestellte Protokoll zeigt, dass das Verfahren qualitativ hochwertiges Gewebe liefert, das beispielsweise mit Immunfärbung und anderen Genexpressionsexperimenten kompatibel ist.

Dissektion des Auge-Hirn-Komplexes aus Fliegenpuppen: Eine Methode zur Isolierung von Netzhautgewebe

Die Entfernung der Augen, auch als Enukleation, bietet eine nützliche Strategie, um Aspekte der visuellen, Cross-Modal und Entwicklungs Plastizität entlang der Säugetier-visuelle System zu studieren, da es teilweise irreversible induziert (monokulare) oder komplett (Fernglas) Verlust der Sehkraft. Hier beschreiben wir eine hoch reproduzierbare und unkomplizierte Ansatz zur in vivo Enukleation durchzuführen.

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Das Ziel dieses Papier und Lehr-Video ist zu beschreiben, wie die Obduktion Schweinehirn und Hypophyse in einem intakten Zustand, geeignet für die anschließende makroskopische und histologische Analyse belichten und zu entfernen.

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Gesichtsausdrücke sind eine Art der visuellen Kommunikation durch mimische Muskeln produziert. Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle für die neuartige Techniken der umgekehrte Dissektion und DiceCT vollständig zu visualisieren und mimische Muskulatur zu beurteilen. Diese kombinierte Techniken können untersuchen, morphologischen und physiologischen Aspekte der mimische Muskulatur, funktionale Aspekte zu bestimmen.

Reverse-Dissektion und DiceCT offenbaren sonst versteckt Daten in der Evolution der Primaten-Gesicht

Die nachstehende Methode zielt darauf ab, ein umfassendes Protokoll für die Herstellung der nichtmenschlichen Primaten-Neurochirurgie (NHP) mit einer neuartigen Kombination aus dreidimensionalen (3D) Druckverfahren und MRT-Datenextraktion bereitzustellen.

Eine MRT-basierte Toolbox für neurochirurgische Planung bei nichtmenschlichen Primaten

Eine gründliche Hochberechnung und standardisierte Schnitte von nicht-neoplastischen Kugeln sind wichtig, um qualitativ hochwertige, reproduzierbare histopathologische Schnitte zu erhalten. Richtlinien für eine standardisierte Bruttoisierung von adulten und fötalen nicht-neoplastischen Globen werden hierin bereitgestellt. Es werden verschiedene Optionen für die Globusschnittung aufgezeigt und diskutiert, einschließlich Kriterien für fallbasierte Entscheidungsfindung.

Bruttoisierung von nicht-neoplastischen Kugeln, einschließlich fötaler Augen

Die Netzhaut weist eine komplexe räumliche Organisation über ihre laminare Struktur auf. Moderne räumliche Transkriptomik- und Sequenzierungstechniken erfordern Gewebeschnitte mit einer Dicke von &lt; 20 μm, was ihre Anwendbarkeit in der Netzhautforschung einschränkt. Diese frisch gefrorene Kryosektionsmethode erzeugt dünne Gesichtsabschnitte der Netzhaut von Mäusen unter Beibehaltung planarer räumlicher Beziehungen und ermöglicht so eine umfassende molekulare Kartierung über Laminae hinweg.

En face Kryosektion der Netzhaut der Maus für die hochdimensionale räumliche molekulare Analyse

Erfahren Sie die Präparation der Netzhaut bei nicht-menschlichen Primaten zur Untersuchung retinaler Strukturen. Diese Methode ermöglicht Einblicke in Entwicklung, Alterung und menschliche Netzhauterkrankungen.

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