Das Tor zum Gehirn: Die Biologie des Primas Eye

Diese Prozedur beginnt mit einem gut durchbluteten Affenkopf. Nachdem das Gehirn entfernt wurde, werden die Augäpfel extrahiert und verbunden. Als nächstes wird das Gewebe entfernt, die Hornhautlinse, die Sklera und der Glaskörper werden vorsichtig entfernt, wodurch die Netzhaut frei wird.

Die Netzhaut wird flach auf einen Objektträger gelegt und der verbleibende Glaskörper wird beseitigt. Anschließend werden Iso Dentrix-Proben entnommen und kryogeschützt. Hallo, ich bin Dr. Mark Burke vom Visual Neurosciences Laboratory an der School of Optometry an der Universität Montreal.

Hallo, ich bin Dr. Shaheen Zur, ebenfalls vom Visual Neurosciences Laboratory an der School of Optometry an der Universität Montreal. Hallo, ich bin Dr. Tito, Direktor des Labors für visuelle Neurowissenschaften an der Schule für Optometrie der Universität Montreal. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zum Präparieren der Netzhaut eines nicht-menschlichen Primaten.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um verschiedene Aspekte der Netzhautorganisation in der normalen Entwicklung und als Reaktion auf Entwicklungseingriffe zu untersuchen. Also lasst uns loslegen. Starten Sie dieses Protokoll mit dem Primatenkopf, den Sie zuvor perfundiert haben.

Nun, mit einem Fixiermittel wie Paraformaldehyd wird die Netzhaut, die hier präpariert werden soll, von einem Grünmeerkatzen geerntet. Um den Erhalt des Auges zu gewährleisten, kann ein Fixiermittel wie Paraformaldehyd direkt unter die Linse injiziert werden. Der Kopf sollte in Fixiermittel oder PBS gelagert werden, bevor man mit der Entnahme der Augäpfel fortfährt, um einen leichteren Zugang zum Augapfel zu erhalten.

Zuerst entfernst du das Gehirn. Um dieses Verfahren zu sehen, lesen Sie unseren kürzlich erschienenen JoVE-Artikel Dissecing the non-human primate brain in stereotaxic space. Wenn das Gehirn entfernt ist, ist der dünnwandige Augenhöhlenknochen leicht zu erkennen.

Verwende die Knochenurs, um die Wand der Augenhöhle langsam abzusplittern. Schneide mit einem Skalpell die Augenmuskeln ab und entferne das Bindegewebe aus dem Augapfel. Zum Schluss schneiden Sie vorsichtig den Sehnerv ab und geben den Augapfel aus der Augenhöhle frei.

Jetzt, da der Augapfel gelöst ist, kann die Netzhaut entfernt werden Um die Netzhaut zu entfernen, legen Sie das Auge zunächst in eine mit Petrischale gefüllte PBS, um die Netzhaut vor dem Austrocknen zu bewahren. Beginnen Sie mit der Entfernung der Hornhaut. Verwenden Sie eine Federschere und schneiden Sie die Sklera nahe dem Umfang der Hornhaut auf Höhe der Ora serrata ein.

Entfernen Sie mit einer Pinzette die Linse. Schließlich, um die Netzhaut von der Sklera zu entfernen. Verwende einen Pinsel, eine Pinzette und eine Federschere.

Trenne die Netzhaut von der Sklera und schneide dann die Sklera mit der Schere weg. Man muss diesen Vorgang in kleinen Schritten durchführen, um eine Beschädigung oder Zerrissenheit des Netzhautgewebes zu vermeiden. Die Sklera lässt sich nicht ohne weiteres vom verbleibenden Sehnerv trennen.

Schneiden Sie also vorsichtig die Sklera um den Sehnerv herum. Die Netzhaut behält ihre gekrümmte Form bei. Entfernen Sie den geleeartigen Glaskörper in einem Klumpen.

Die Netzhaut ist nun bereit für die Montage und Bemusterung. Um die Netzhaut auf einen Objektträger zu glätten, machen Sie mehrere radiale Schnitte mit einer Skalpellklinge. Verwenden Sie gewöhnliches Filterpapier und einen Pinsel, um den restlichen Glaskörper zu entfernen.

Es ist unerlässlich, bei diesem Schritt vorsichtig vorzugehen, da er die retinale Ganglienzellschicht freilegt. Prüfen Sie, ob der Sehnerv noch an der Sehscheibe befestigt ist. Verwenden Sie eine Skalpellklinge und eine Federschere, um den Sehnerv zu entfernen, ohne die Netzhaut zu zerreißen.

Montieren Sie nun die Netzhaut flach auf einem zwei mal drei Zoll großen Glasobjektträger, wobei eine retinale Ganglienschicht vom Objektträger entfernt ist. Die Fovea ist nun als dunkler Fleck in temporaler ventraler Richtung von der Papille aus sichtbar. Um die retinale Ganglienzellschicht zu untersuchen, muss das pigmentierte Epithel möglicherweise entfernt oder gebleicht werden.

Entferne mit einem Pinsel leicht etwas von dem pigmentierten Epithel. Beachten Sie, dass diese Methode dazu neigt, die Photorezeptorschicht zu beschädigen. Die Untersuchung der Zellverteilung und Morphologie jeder Schicht in der Netzhaut erfordert eine isometrische Probenahme der Netzhaut.

Beginnen Sie damit, die Netzhaut flach auf einem Objektträger zu befestigen und PBS hinzuzufügen, um die Netzhaut feucht zu halten. Schneiden Sie dann kleine Gewebestücke in gleichem Abstand zur Sehscheibe in nasaler, temporaler, oberer und unterer Richtung. Diese geschnittenen Stücke können nun in der koronalen Ebene mit einem Kryostaten, Vibrato oder Ultramikrotom geschnitten werden.

Je nach Forschungsfragestellung. Für die Kryostaten-Schnitte sollten die Stücke über Nacht bei vier Grad Celsius in 30%iger Saccharose in Phosphatpuffer kryogeschützt werden. Nach der Inkubation über Nacht frieren Sie die Netzhautstücke in einem Eindeckmedium auf Trockeneis ein.

Verwenden Sie den Kryostaten, um Schnitte mit einer Dicke von nur vier Mikrometern zu erhalten. In unserem Labor führen wir routinemäßig Immunhistochemie an Kryo-Schnittnetzhaut durch. In diesem Fall interessieren wir uns für die Isodichte der Cannabinoid-Rezeptoren in der Netzhaut von Primaten.

Wir untersuchen auch die Auswirkungen einer pränatalen Ethanolexposition auf das visuelle System von Primaten. Zu diesem Zweck interessieren wir uns für die Zelldichte und Schichtdicke in der Fovea und in der peripheren Netzhaut. Um dies zu erreichen, betten wir Netzhautstücke in eine Eponscheibe bei 700 Nanometern auf ein Ultramikrotom ein und färben sie mit 1%toin. Blau.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie die Netzhaut eines Primaten bei diesem Verfahren präparieren können. Es ist wichtig, daran zu denken, die retinalen Ganglien, die Zellschicht oder die Photorezeptorschichten nicht zu beschädigen. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.