Name: Oogsten en voorbereiden Drosophila Embryos voor elektrofysiologische opname en andere procedures (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-20T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Leer hoe je Drosophila-embryo's oogst en prepareert voor elektrofysiologische opnames. Deze methode onthult het neuromusculaire systeem voor onderzoek naar vroege ontwikkeling en functie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

KB wordt ondersteund door NIH subsidie ​​GM54544.

Deel 1: Uitrusting en Proviand <ol><li> Een goede dissectie microscoop nodig is voor embryo dissecties, 40x vergroting wordt voorgesteld, met 25x eye-stukken te verhogen tot maximaal vergroting. </li><li> Fijn pincet (nummer 5) zijn vereist voor handmatige selectie van embryo&#39;s en devitellinization van embryo&#39;s. </li><li> Apparatuur te maken en aan te passen goed glas naalden is noodzakelijk. Getrokken glas naalden nodig zijn voor de dissectie. Wij geven de voorkeur stevig glas voor dissectie (langer), maar standaard dikwandige glazen buis (buitendiameter 1-1,5 mm) werkt ook. Sommige mensen gebruiken fijne naalden wolfraam, geëlektrolyseerd om de gewenste scherpte in een bad van 1 M NaOH met behulp van een 10 + Amp autotransformer batterij. Geslepen wolfraam dissectie naalden hebben het voordeel dat ze relatief veerkrachtig en duurzaam. Hol glas naalden (gevormd vergelijkbaar met klem elektroden patch) zijn gekoppeld aan plastic buizen en gebruikt tijdens de dissectie voor zuig-en uitzetting van zout, evenals de gecontroleerde afgifte van lijm. Een verscheidenheid van glas trekkers zijn beschikbaar voor de productie van glas naalden. Computer-geprogrammeerde trekkers kan worden ingesteld op een verscheidenheid van vormen en maten trekken. De Brown-Flaming modellen (Sutter Instrument Co) worden op grote schaal de voorkeur. Een samengestelde microscoop (20-40X objectief) moeten beschikbaar zijn voor inspectie en de elektroden te passen voor gebruik. </li><li> Er zijn twee soorten oplossingen worden vaak gebruikt om baden van de embryonale weefsels tijdens de dissectie: 1) &quot;standaard&quot; (Jan en Jan, 1976a) of &quot;gewijzigde standaard&quot; (Broadie, 2000) Salines, gebaseerd op oplossingen vaak gebruikt voor het opnemen in andere ongewervelde systemen , en 2) &quot;hemolymfe-achtig&quot; (HL) Salines (Stewart et al., 1994), een compromis tussen de standaard zoutoplossing en de ionische concentraties gemeten in de Drosophila hemolymfe. Opgemerkt moet worden dat geen van deze Salines nauwkeurig de chemische samenstelling van hemolymfe in vivo (Broadie, 2000) na te bootsen. Standaard zoutoplossing bevat (in mm): 135 NaCl, KCl 5, 4 MgCl 2, 1,8 CaCl2, 72 sucrose, 5 TES, pH 7,2. Onderzoekers kunt ook commercieel bereid insect zoutoplossing (Insect Media bv Schneider), die ongeschikt is voor elektrofysiologische opname, maar het meest waarschijnlijk voor de gezondheid van de blootgestelde weefsels te beschermen overwegen. </li></ol> Deel 2: Embryo Staging en Dissection <ol><li> Voor een optimale eieren ophalen, onderhouden jonge (&lt;7 dagen), gezonde mannelijke en vrouwelijke vliegen (20-40) van verse leggen potten voor 2-3 dagen. Leggen potten vaak bestaan ​​uit 100 ml plastic bekertjes (Tri-Pour) geperforeerd voldoende luchtcirculatie, waarbij een 60 mm agarplaat te bieden. Agar-platen bevatten appel-of druivensap verhard met agar. Verschillende recepten bestaan, maar een voorbeeld is als volgt: 700 ml water, 25-30 gram agar, 300 ml sap concentraat (druif of appel), 0,5 g methyl paraben (p-hydroxymethylbenzoate), en 30g suiker. Autoclaaf het water en de agar, en afzonderlijk de p-hydroxymethylbenzoate kook met de suiker en het sap. Meng de agar en sap oplossingen en snel giet het geheel in 60 mm platen, het verwijderen van luchtbellen. </li><li> Voorafgaand aan de eieren ophalen, zijn vliegen gevoed met gist pasta (7 gram bakkersgist in 9 ml water opgeslagen bij 4 ° C) op verse platen, ten minste tweemaal per dag veranderd voor ten minste twee dagen. Per dag 3, zou een goede pot te produceren 100-200 eieren per uur. Beter de eileg is waargenomen op een pot blijven op zijn kant met de agar in de plaat gekrast. Veel embryo&#39;s zullen worden opgenomen in of naast de krassen. </li><li> Voor het verzamelen van grote aantallen embryo&#39;s, voorzichtig overdracht van de embryo&#39;s uit de agarplaat in een mand met behulp van een penseel. Een mand kan worden gemaakt met een 15 of 50 ml centrifugebuis. Snijd de onderkant verlaten van voldoende oppervlakte om een ​​scherm (70 um mesh) tussen het deksel en de bovenkant van de buis val. Spoel de embryo&#39;s met dH 2 0 en in een petrischaal van verse 50% tot 100% bleekmiddel naar de buitenste chorion te verwijderen. Als alternatief kunnen de eieren afzonderlijk worden verzameld met behulp van fijn pincet en dechorionated door ze handmatig in een druppel bleekmiddel. De-chorionation kunnen nemen van 30 seconden tot 2 minuten (verse bleekmiddel is veel sneller), en dienen gecontroleerd te worden onder de microscoop dissectie. Verwijdering van de chorion bloot de glanzende, transparante vitelline membraan. Dechorionated eieren moeten kort worden gespoeld, of geplaatst in een zoutoplossing, zoals bleekmiddel snel vernietigt devitellinized weefsels. </li><li> Het is van cruciaal belang om zorgvuldig stadium embryo&#39;s om de gewenste ontwikkeling leeftijd. De gedefinieerde Drosophila embryonale fase (1-17, Campos-Ortega en Hartenstein, 1985) zijn niet zinvol, omdat alle functionele neuromusculaire ontwikkeling gebeurt in een vergevorderd stadium of fase 16 17. Zo, de embryo&#39;s zijn geënsceneerd door ontwikkelingspsychologen uur bij 25 ° C in een bevochtigde incubator, in het uur na de bevruchting, of, meer in het algemeen, na de eileg (AEL). Onder deze omstandigheden, embryogenese duurt 21 + / - 1 uur bij 25 ° C. </li><li> Eieren van een timed ei-lay (1-2 uurs) die op passende wijze worden leeftijd naast bekeken voor morfologische criteria. Na uitgebreid wassen in dH 2 O, zijn de dechorionated gebrachte eieren in een plastic schaaltje cultuur (onder dH 2 O) voor het bekijken. De juiste enscenering kan worden bevestigd met behulp van morfologische criteria gereflecteerd licht met een dissectie microscoop (Campos-Ortega en Hartenstein, 1985). Ouder laat stadium embryo&#39;s (22-24u AEL) op de rand van het uitbroeden zijn over het algemeen erkend door het segmenteren van de cuticula en opgeblazen luchtpijp. Embryo&#39;s kunnen ook worden gegenotypeerd met behulp van GFP balancers en een fluorescentie microscoop dissectie met passende filters. </li><li> Voor de dissectie, dechorionated en ontwikkelingsgebied geënsceneerd embryo&#39;s zijn verbonden (dorsale zijde naar boven) op een dekglaasje onder een druppel zoutoplossing (zie stap 1.5). Embryo&#39;s worden verwijderd van de vitelline membraan door aanprikken van de membraan de buurt van de voorste of achterste eindigen met een glas micropipet of wolfraam naald, en dan zachtjes het bevrijden van de embryo van het membraan. Ter voorbereiding van dissectie, moet het embryo worden geplaatst op het dekglaasje met de dorsale oppervlak tot (Dorsale zijde naar boven dissectie zal het ventrale zenuwstelsel en neuromusculature voor experimenten bloot te leggen. Echter, het embryo kan natuurlijk worden geplaatst op andere manieren om de toegang tot andere weefsels.) </li><li> Vroeg stadium embryo&#39;s (&lt;16 uur AEL) rechtstreeks op glas of glas, gecoat met polylysine (poly-L-lysine hydrobromide, Broadie en Bate, 1993a, b) schoon te maken. Oudere embryo&#39;s (&gt; 16 uur AEL), na cuticula vorming, moet worden gelijmd, ideaal om te Sylgard-coated (Dow Corning) dekglaasjes. Een water-polymerisatie van cyanoacrylaat chirurgisch of veeartsenijkundig lijm wordt gebruikt (Broadie en Bate, 1993c, d). De lijm wordt geleverd door middel van een klein glas electrode pipet (10-20 micrometer binnendiameter tip) bevestigd aan een rubberen buis met de lijm stroom gecontroleerd door de mond druk. Zorg moet worden genomen tijdens lijm levering, als de lijm polymeriseert snel na contact met de zoutoplossing. Merk ook op dat lijmen kan niet worden uitgevoerd in een zoutoplossing met geen of een lage tweewaardige ion concentraties, omdat de lijm vereist tweewaardige ionen polymeriseren tot. Kleine hoeveelheden lijm worden eerst gebruikt om stevig bevestigen van de kop en de staart. </li><li> Zodra de uiteinden van het embryo worden vastgelijmd aan het dekglaasje, wordt een incisie gemaakt langs de dorsale middellijn met een glazen elektrode of aangescherpt wolfraam naald. Dit wordt gemakkelijker gemaakt door zacht perforeren de lijn van de incisie voorafgaand aan het maken van de uiteindelijke versie. De zijkanten van de incisie wordt vervolgens gekoppeld aan het dekglaasje met meer lijm, om zachtjes verspreiding van de embryo plat. De interne organen zoals de darm, dikke lichamen en, optioneel, de luchtpijp worden vervolgens verwijderd door afzuigen met behulp van een glazen pipet aan rubber slang (Broadie en Bate 1993a-c). Het embryo moet nu worden bevestigd plat op het dekglaasje, opperhuid weg met de ventrale centrale zenuwstelsel, perifere zenuwen, en somatische spieren worden blootgesteld voor experimenten. </li></ol>

Nauwkeurige stadiëring van embryo&#39;s is van cruciaal belang te wijten aan de snelle rijping van de functionele eigenschappen over het tijdsverloop van slechts enkele uren. Aantal problemen compliceren deze enscenering. De eerste, de meeste onderzoekers gebruiken getimed ei legt op het podium embryo&#39;s, maar het ei leggen de tijd kan enorm variëren van dier tot dier in verschillende omstandigheden (Broadie et al.. 1992). In het bijzonder vrouwen op een beperkt dieet de neiging om bevruchte eieren gedurende langere ...

<table><tbody><tr><td>Kooitjes voor embryo-verzameling</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-100 (voor 60 mm schaal; andere maten beschikbaar)</td><td>Kooitjes kunnen ook zelf worden gemaakt met geperforeerde driepootbekers, zoals getoond in de video</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>Beschikbaar bij verschillende leveranciers</td><td>Chirurgische lijm hecht beter aan met sylgard gecoate dekglasjes</td></tr><tr><td>Fijne glazen buisjes, buitendiameter 1,0-1,5 mm</td><td>Diverse</td><td></td><td>Voor het uitrekken tot fijne glazen naalden voor dissectie en buisjes voor het aanbrengen van lijm</td></tr><tr><td>Plastic slang, om aan glazen pipet te bevestigen voor mondzuiging en lijmaanbrenging</td><td>Tygon</td><td></td><td>De binnendiameter van de slang moet overeenkomen met de buitendiameter van het glas.</td></tr></tbody></table>

oogsten en voorbereiden drosophila embryo&#39;s voor elektrofysiologische opname en andere procedures

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila is een vooraanstaande genetisch model voor de studie van zowel de embryonale ontwikkeling en functionele neurowetenschappen. Traditioneel worden deze velden geïsoleerd nogal van elkaar, met grotendeels onafhankelijke geschiedenis en wetenschappelijke gemeenschappen. Echter, de interface tussen deze vaak uiteenlopende terreinen is de ontwikkelingsprogramma&#39;s ten grondslag liggen aan de verwerving van functionele elektrische signaal-eigenschappen en de differentiatie van de functionele chemische synapsen tijdens de laatste fasen van neurale circuit formatie. Deze interface is een uitermate belangrijk gebied voor onderzoek. In Drosophila, deze fasen van de functionele ontwikkeling optreden tijdens een periode van &lt;8 uur (bij 25 ° C) tijdens het laatste derde deel van de embryogenese. Deze late ontwikkelingsfase werd lang beschouwd als hardnekkige het onderzoek als gevolg van de afzetting van een zware, ondoordringbare epidermale cuticula. Een doorbraak van tevoren was de toepassing van de water-polymeriseren chirurgische lijm die lokaal kan worden toegepast op de cuticula om gecontroleerde dissectie van de laat-stadium embryo&#39;s mogelijk te maken. Met een dorsale longitudinale incisie, kan het embryo te plat, waardoor de ventrale zenuw snoer en de lichaamswand spieren aan experimenteel onderzoek. Dit systeem is zwaar gebruikt voor het isoleren en karakteriseren van genetische mutanten dat embryonale synapsvorming aantasten, en dus onthullen de moleculaire mechanismen voor de specificatie en differentiatie van synaps verbindingen en functionele synaptische signalering eigenschappen.

Deze techniek onthult de Drosophila embryonale neuromusculature voor immunohistochemie of elektrofysiologische opname. Het is handig voor het bestuderen van vroege gebeurtenissen in neuromusculaire ontwikkeling of het uitvoeren van elektrofysiologie in mutanten die niet kan uitkomen.

Oogsten en voorbereiden Drosophila Embryo&#39;s voor elektrofysiologische opname en andere procedures

Drosophila is een uitmuntend genetisch model voor de studie van zowel de embryonale ontwikkeling als de functionele neurowetenschappen. Traditioneel zijn deze vakgebieden vrij ...

Om elektrofysiologische opnames uit te voeren in drosophila-embryo's, moeten deze eerst worden geoogst, gecoördineerd en gedissecteerd; een gecontroleerde dissectie is mogelijk met waterpolymeriserende chirurgische lijm, die de embryo's op dekglasplaatjes stabiliseert. De interne organen worden vervolgens uit de gestabiliseerde embryo's verwijderd om het ventraal centraal zenuwstelsel, de perifere zenuwen en de somatische musculatuur bloot te leggen. Hallo, ik ben Dave Featherstone van de afdeling Biological Sciences hier aan de University of Illinois in Chicago.Hoi, ik ben Ton van het lab van Dave Featherstone van de afdeling Biological Sciences aan de University of Illinois in Chicago. Vandaag gaan we laten zien hoe je late-stadium embryo's van Joof verzamelt en handmatig dissekeert. We gebruiken deze algemene laboratoriumprocedure ter voorbereiding op elektro-alternatieve testen van de ontwikkeling en functie van het neuromusculaire systeem van Joof, wat ik zal demonstreren in een volgende JoVE-presentatie.Laten we beginnen. Dit protocol start met het verzamelen van embryo's, een gangbare procedure die in diverse joof-experimenten wordt gebruikt en die we nu zullen bespreken. Pl

harvesting-preparing-drosophila-embryos-for-electrophysiological

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video toont de bereiding van primaire neuronale culturen uit midgastrula podium Drosophila embryo's. Standpunten van levende culturen tonen cellen 1 uur na de beplating en gedifferentieerde neuronen na 2 dagen van groei in een bicarbonaat-based gedefinieerd medium. De neuronen zijn elektrisch prikkelbaar en vormen synaptische verbindingen.

De voorbereiding van Neuronale Culturen van Midgastrula Stage Drosophila embryo&#39;s

Een eenvoudige, goedkope en effectieve methode voor de bereiding Drosophila embryo's voor live-imaging analyse wordt gepresenteerd. Onze-protocol zorgt voor vochtigheid en gas uit te wisselen en comprimeert niet de Drosophila embryo. Deze methode is geschikt voor het GFP-gebaseerde live beeldvorming van Drosophila embryo's met behulp van een stereomicroscoop of rechtop samengestelde microscoop.

De voorbereiding van Drosophila Embryo&#39;s voor Live-Imaging Met behulp van de Opknoping Drop Protocol

Elektrofysiologische opname in de Drosophila Embryo

We beschrijven een proces voor fixatie, inbedden, snijden, en de beeldvorming van laat...

De voorbereiding van embryo&#39;s voor Elektronenmicroscopie van de Drosophila Embryonale hart buis

Hier beschrijven we een geheel gemonteerde...

Hele Mount RNA TL<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s

Het doel van dit protocol is om een ​​eenvoudige en goedkope aanpak te geven voor het verzamelen van Drosophila embryo's op middelgrote schaal (0,5-1 g) en het bereiden van eiwit extracten die kunnen worden toegepast in stroomafwaartse proteomische toepassingen, zoals affiniteitszuivering-massaspectrometrie (AP-MS ).

Middelgrote voorbereiding van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo Extracten voor Proteomische Experimenten

Dit werk beschrijft een protocol voor het genereren van hoge resolutie in situ Hi-C bibliotheken van strak geënsceneerd pre gastrulatie Drosophila melanogaster embryo's.

Generatie van genoom-brede chromatine conformatie Capture bibliotheken uit strak geënsceneerde vroege Drosophila embryo 's

We beschrijven een methode voor het retrograde traceren van de Drosophila embryonale motorneuronen met behulp van lipofiele fluorescerende kleurstoffen.

Retrograde tracing van Drosophila embryonale motor neuronen met behulp van lipofiele fluorescerende kleurstoffen

Hier gepresenteerd is een protocol om micro-injectie en tegelijkertijd beeld meerdere Drosophila embryo's tijdens de embryonale ontwikkeling met behulp van een plaat-gebaseerde, hoog gehalte imager.

Drosophila Embryo Preparatuur en microinjectie voor live celmicroscopie uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde high content analyzer

Actomyosine contractiliteit speelt een belangrijke rol in cel- en weefselmorfogenese. Het is echter een uitdaging om actomyosinecontractiliteit in vivo acuut te manipuleren. Dit protocol beschrijft een optogenetisch systeem dat snel Rho1-gemedieerde actomyosinecontractiliteit in Drosophila-embryo's remt, waardoor het onmiddellijke verlies van epitheliale spanning na de inactivatie van actomyosine in vivo wordt onthuld.

Optogenetische remming van Rho1-gemedieerde actomyosinecontractiliteit in combinatie met meting van epitheliale spanning in Drosophila-embryo's

Leer hoe je Drosophila-embryo's oogst en prepareert voor elektrofysiologische opnames. Deze methode onthult het neuromusculaire systeem voor onderzoek naar vroege ontwikkeling en functie.

Oogsten en voorbereiden Drosophila Embryo's voor elektrofysiologische opname en andere procedures

Meer video's verkennen