תיוג של פלורסנט תסיסנית לב מבנים

היי, אני ניקיטה ארי מהמעבדה של ראלף בור בתוכנית להתפתחות והזדקנות במכון ברנהם למחקר רפואי. אני גיל לר גם מהמעבדה התחתונה. היום אנו הולכים להראות לכם נהלים לתיוג פלואורסצנטי של מבני לב לאוול וקדם-שמש בוגרים.

אנו משתמשים בהליך זה במעבדה כדי להכין את צינורות הלב לניתוח מורפולוגי ומבני באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית או פלואורסצנטית על מנת לסמן באופן פלואורסצנטי מבני לב בדרוזופילה בוגרים. ראשית, בצע חתך בודד בין בית החזה לבטן במבוגר שלם למחצה כדי להפריד בין חלקי הגוף. לאחר מכן חתוך את קצוות הגחון התלויים של הציפורן הבוגרת.

לאחר מכן, העבירו וסמנו דגימות זחל בוגרות או מנותחות עם נוגדנים ראשוניים ומשניים. לאחר תושבת התיוג שטפו דגימות בוגרות על ידי החזקת קצוות הציפורן והנחתם עם צד הלב כלפי מטה על טיפת מגן וקטורי על פתק כיסוי, הפוך את החלקה על טיפה של מדיום משני צדיה שני החלקות כיסוי על מגלשה ליצירת גשר. כשהלבבות תלויים כעת זקופים ללבבות זחלים גוברים.

העבירו דגימות למגלשה כשצידי הגחון פונים כלפי מטה הרכיבו שני החלקות כיסוי משני צידי המגלשה. לבסוף צרו גשר עם החלקת כיסוי שלישית על ידי הנחתו תחילה על החלקת הכיסוי ליד הקצוות האחוריים של הזחלים. הלבבות מוכנים כעת להדמיה.

לפני שתתחיל בהליך זה, הכן את המאגר הבא A DH מרגיע המכיל A DH כמתואר בפרוטוקול וידאו אחר בסדרה זו עם קיבוע EGTA של 10 מילי-מולרי המורכב מ-4% פורמלדהיד ב-X-P-B-S-P-B-S, TX אחד, ונוגדנים ראשוניים מדוללים כראוי ונוגדנים משניים המסומנים פלואורסצנטית. ב- PBS TX נתח דרוזופילה בוגרת וזחל כדי לחשוף את צינורות הלב בעקבות הכנת לב הדרוזופילה השלמה למחצה המוצגת בפרוטוקולי הווידיאו המדמיינים את הלב הפועם בפרוטוקול דיסקציה NMJ של זחל דרוזופילה ודרוזופילה. אך עם שינויים, השתמש ב-DH מחומצן במהלך דיסקציה של הזחל והזיז מעט את הסיכות האחוריות מזחל קו האמצע הגחוני.

חותכים לאורך קו האמצע הגחוני. אל תסיר רקמה כלשהי לפני הקיבוע בשלבים הבאים. התחל את הליך התיוג על ידי בדיקה תחת מיקרוסקופ שכל הלבבות מתכווצים באופן קצבי ונרגעים ב-A DH מחומצן. לאחר מכן החליפו במהירות DH במאגר מרגיע ובחנו מחדש כל צינור לב כדי להבטיח עיכוב התכווצויות.

המשך לתקן את הלבבות על ידי החלפת המאגר המרגיע במקבע. דוגרים בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות עם ניעור עדין. שימו לב כי עבור תכשירי זחלים טלטול אינו הכרחי בשום שלב ואף עלול להזיק לשלמות רקמת הלב.

בתום 20 דקות, הסר את הקיבוע ושטוף את הדגימות שלוש פעמים במשך 10 דקות בכל פעם עם P-B-S-T-X. בטמפרטורת החדר עם טלטול מתמשך למבוגרים, בצע חתך בודד בין הבטן לבית החזה בזהירות ובצורה נקייה. הפרד את שני חלקי הגוף כדי להבטיח נזק מינימלי לאזור הקדמי של הלב.

היזהר לא לחתוך לחלק הבטן הקדמי שבו נמצא החדר החרוטי של הלב. בדוק את הדגימה תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שבוצע חתך נקי. לאחר מכן, חתוך בזהירות את כל קצוות הגחון התלויים של ציפורן הבטן, כך שמה שנשאר יהיה אליפטי יותר ופחות עגול.

עבור לבבות זחלים המשתמשים במלקחיים עדינים, הסר בזהירות את גוף השומן. בצע זאת בזהירות רבה. מכיוון שלב הזחל שביר במיוחד ויש לו מעט מאוד תמיכה משרירים אחרים או רקמת חיבור, אל תסיר את ענפי קנה הנשימה מכיוון שהדבר עלול לפגוע בלב.

לאחר מכן, דגרו עם הנוגדן הראשוני, המדולל ב-PVS TX ומחולק ב-50 מיקרוליטר לבאר של צלחת של 96 בארות. עבור זבובים בוגרים, החזיקו את הציפורן הגבית הגזומה בקצוות מבלי לגעת בצינור הלב הממוקם במרכז והעבירו לצלחת. מניחים לא יותר מ -12 דגימות לבאר ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך שעתיים עם תסיסה מתמשכת.

החזיקו דגימות זחלים בקצה באמצעות מלקחיים והעבירו ל-P-B-S-T-X מלא. ובכן, שוב, אל תנערו את דגימות הזחל בסוף הדגירה. הסר את תמיסת הנוגדנים העיקרית.

שטפו את הלבבות שלוש פעמים במשך 10 דקות בכל פעם עם 100 מיקרוליטר P-B-S-T-X בטמפרטורת החדר לאחר הכביסה האחרונה ב-100 מיקרוליטר של הנוגדן המשני ב-PBS tx בתוספת Alexa 5 9 4 Phin. שמור את הדגימות מכוסות כדי למנוע הלבנת פלואורו ארבע מעתה ואילך ודגירה למשך שעה בטמפרטורת החדר. הסר את תמיסת הנוגדנים המשנית ושטוף את הלבבות שלוש פעמים במשך 10 דקות בכל פעם עם 100 מיקרוליטר P-B-S-T-X בטמפרטורת החדר.

לבסוף, הסר את ה-TRITTON X 100 על ידי שטיפת הלבבות ב-100 מיקרוליטר PBS למשך 10 דקות. ניתן לאחסן את הדגימות בחושך בארבע מעלות צלזיוס למשך מספר ימים לפני ההרכבה. ראשית, הכינו את השקופית להרכבה.

החל שלוש במרווחים שווים. 10 טיפות מיקרוליטר של מדיום הרכבה של מגן וקטורי על מיקרוסקופ. החלק הנח שני החלקות כיסוי בגודל 18 על 18 מילימטר על הטיפות החיצוניות, תוך שמירה על החלקות הכיסוי במרחק של כ-10 עד 15 מילימטרים זו מזו.

בנוסף, הנח 20 מיקרוליטר של מגן וקטורי במרכז תלוש כיסוי שלישי. לאחר מכן, החזק את הזבוב הבוגר המנותח בקצוות הקיצוניים של הציפורן. כדי להסיר אותו בזהירות מתמיסת הכביסה PVS, הנח אותו בעדינות כשצד הלב כלפי מטה על טיפת אמצעי ההרכבה בהחלקת הכיסוי השלישית לא יותר מחמישה לבבות לטיפה על החלקת הכיסוי.

לאחר הנחת הלבבות על הטיפה, שנמצאת על החלקת הכיסוי, בדוק מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שכל הלבבות פונים כלפי מטה. כעת הפוך בזהירות את פתק הכיסוי עם הלבבות והנח אותו במהירות על המגלשה המחזיקה את זוג פתקי הכיסוי כך שהטיפה של פתק הכיסוי ההפוך המכילה את צינורות הלב מתמזגת עם טיפת המגן הווקטורי המונחת ברווח שבין החלקות הכיסוי. זוג בדרך זו, שלושת החלקות הכיסוי יוצרות גשר.

הלבבות יהיו תלויים בין החלקה האמצעית למיקרוסקופ. החלק מתחת לגשר בדוק מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שלבבות הזבובים הבוגרים פונים כעת כלפי מעלה באמצעות לק. תקן את החלקות הכיסוי בקצוותיהם.

הלבבות מוכנים כעת להדמיה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית או קונפוקלית. כדי להרכיב לבבות זחלים, הניחו טיפה של כ-20 מיקרוליטר מגן BTA על מגלשת מיקרוסקופ באמצעות מלקחיים עדינים. אחזו בזחלים בשולי הציפורן והעבירו אותם בזהירות לטיפה.

כוון את הזחלים בצד הגב כלפי מטה באמצעות מחטי טונגסטן. מניחים עד שני זחלים על שקופית אחת. לאחר מכן, גרור כל דגימה ממדיום ההרכבה ויישר את הזחלים במקביל.

הניחו פתק כיסוי בכל צד של הלבבות המיושרים באמצעות מלקחיים. הנח תחילה פתק כיסוי שלישי למעלה על ידי הנחת צד אחד על החלקת הכיסוי הקדמי והורדתו עד להחלקת הכיסוי האחורית. וכך נוצר גשר.

כוחות נימיים יגרמו לזרימה של מגן וקטורי מאחור לחזית, מה שמסייע ליישור נכון של לב הזחל. לבסוף, קבעו את כל החלקות הכיסוי במקומם בקצוות שלהן בעזרת לק ומלאו בזהירות את הרווח בין החלקות הכיסוי ב-20 עד 30 מיקרוליטר של אטם מגן וקטורי עם לק ואחסנו בארבע מעלות צלזיוס לאחסון לטווח קצר או במינוס 20 מעלות צלזיוס לפרק זמן ארוך יותר. כאשר מבוצעים כהלכה, כל הרכיבים והרקמות הנלוות של כלי הגב צריכים להישאר שלמים ולהיות נראים בקלות.

הקרינה ברקע צריכה להיות מינימלית למבוגרים. שכבת השריר האורכית הגחונית מוכתמת היטב ומייצרת אות משמעותי. הקרדיומיוציטים המעגליים הבסיסיים, לעומת זאת, נוטים לא לייצר אות עז כמו זה שמגיע משכבת הגחון שמעליו.

המיוציטים של החדר החרוטי הקדמי של הלב הבוגר מכילים כמות ניכרת של חומר מתכווץ, וכתוצאה מכך, אזור זה נראה כחזק ביותר ביחס לשאר צינור הלב. התמונה של לב הזחל מציגה סידור סיבי מיו ספירלי. בדומה לזה של קרדיומיוציטים מתכווצים בוגרים, זה עתה הראינו את הפרוטוקול שלך להכנה וצביעה של לבבות ביציים למיקרוסקופיה פלואורסצנטית וקונפוקלית.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להגביל כל טיפול מיותר. זה יבטיח מבנה לב שלם ושמור טוב יותר. פרוטוקול זה משמש רק כנקודת התחלה.

כמו בכל אימונוהיסטוכימיה אחרת, נוגדנים שונים דורשים תנאים שונים ויש לבצע אופטימיזציה אינדיבידואלית. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה עם הצביעה שלך.