Методы изучения данио рерио Верхнечелюстная Барбель

Мраморы представляют собой гетерогенную коллекцию сенсорных структур, обнаруженных у амфибий, рептилий и рыб. У рыбы данио развиваются две пары шариков, меньшая носовая пара и большая верхняя пара. Эти прозрачные придатки могут быть использованы для изучения развития, поддержания и регенерации нескольких типов клеток рыбок данио.

В этом видео рассказывается о развитии верхнечелюстного мрамора и демонстрируется хирургический протокол для стимуляции регенерации. Заусеницы собирают через несколько дней или недель, после чего вскрывают и внедряют регенераты и контрольные образцы. Здравствуйте, я Элизабет Леклер из лаборатории Леклера в Университете Де Поля, и я Я Чески из Северо-Западного университета Фрид оф Медик и Детского мемориального исследовательского центра.

Сегодня мы покажем вам некоторые процедуры изучения максиллярного мрамора данио-рерио. Мы используем эти процедуры для изучения роста и развития рыбок данио-рерио. Итак, приступим.

Примерно через 30-40 дней после оплодотворения верхнечелюстная штанга выглядит как прозрачная эпителиальная почка рядом с задним вентральным углом верхней челюсти. По мере взросления данио-рерио штанга расширяется в узкий отросток для ног с усами, длиной в несколько миллиметров. Зрелая штанга содержит несколько важных типов клеток, включая пигментные клетки, клетки желез, вкусовые рецепторы, кровеносные сосуды и миелинизированные нервы.

Лучше всего то, что мрамор прозрачен на всех этапах своего развития. Как и другие органы рыбок данио, верхнечелюстная штанга может регенерировать после проксимальной ампутации. В этом разделе мы продемонстрируем процедуру зажимания штанги у основания верхней челюсти.

Это также можно назвать односторонней эктомией. В день операции подготовьте два небольших резервуара с рыбьей водой, один для анестезии, а другой для восстановления. Резервуар для анестезии содержит 0,015% трики, буферизованных до pH 7,0.

В рыбной воде резервуар для восстановления содержит рыбу, воду и каплю метиленового синего для борьбы с грибковыми инфекциями. Обезболите от одной до трех взрослых рыб данио, погрузив их в аквариум с трикой, наблюдайте до тех пор, пока плавательные движения не прекратятся, а вентиляция желудочно-кишечного тракта не станет медленной и регулярной. В зависимости от размера рыбы, полная анестезия может занять от двух до пяти минут.

Используйте сачок для аквариумных рыбок, чтобы переложить рыбок на кусок влажного бумажного полотенца на чашке Петри. С помощью тупого шпателя сориентируйте рыб так, чтобы они были параллельны друг другу. Левой боковой стороной вверх накройте рыб частью бумажного полотенца, чтобы они оставались влажными.

Затем рассмотрите пластину Петри под стереомикроскопом, используя падающий свет под низким углом для освещения головы. Сосредоточьтесь на основании левого верхнечелюстного мрамора с помощью тонких щипцов. Крепко возьмитесь за мраморный стержень немного дистальнее края верхней челюсти.

Поднимите шарик и вставьте пружинные ножницы с тонким наконечником прямо рядом с щипцами для устойчивости. Ножницы могут касаться щипцов или поочередно нижней части пластины Петри. Проведите губками ножниц вдоль стержня шарика до тех пор, пока режущая кромка не приблизится к краю верхней челюсти.

Прорежьте мраморный стержень и удалите ампутированный мрамор. Эту ткань можно зафиксировать и проанализировать отдельно. После операции пересадите рыбок в восстановительный резервуар.

Дайте рыбе восстановиться в течение нескольких часов или на ночь и верните рыбу в систему выращивания. Подождите одну-две недели, пока не произойдет регенерация бородки. В следующем разделе мы покажем вам, как подготовить несъемную мраморную ткань к анализу.

Эта процедура начинается с шариков, которые были собраны и зафиксированы через дни, недели или месяцы после операции. Промойте неподвижную ткань в буферном солевом растворе и рассеките регенерированный мрамор с левой стороны головы. Не забудьте про правый колючок, который служит контролем для временного хранения.

Пипеткой каждую подобранную пару шариков снесите в несколько капель физиологического раствора на чашке Петри. Накройте крышкой и оставьте на скамейке, пока вы идете. Заставьте гель нагреть до 150 миллилитров 2%агроса до полного растворения.

Уравновесьте раствор на водяной бане при температуре от 50 до 60 градусов Цельсия. Затем соберите стандартную установку для гель-электрофореза и добавьте от одного до четырех маленьких зубьев к образцу. Вылейте растопленный агрос в форму для геля на ровной поверхности, добавив ровно столько, чтобы образовалось несколько очень неглубоких лунок.

Сразу же верните остатки ароса на ванну с теплой водой. Вставьте длинную стеклянную пастбищную пипетку так, чтобы пипетка достигла той же температуры, что и арос. После того как гель остынет, снимите расчески, а затем гелевую форму.

Чтобы закрепить гель прочно, заклейте с обеих сторон лентой вашего любимого цвета лабораторным скотчом. Лента должна выступать на несколько миллиметров над поверхностью арос таким образом, чтобы в дальнейшем можно было залить дополнительные агро в расположении гелевой формы на столе стереомикроскопа. Увеличьте пустую лунку и сфокусируйте края.

Пипеткой выводите шарики из чашки Петри на поверхность геля, прилегающую к лунке, с помощью ручек с изогнутыми булавками от насекомых. Перетащите шарики в колодец и опустите их на дно. Выровняйте штанги параллельно друг другу и по длинным краям лунки Перед заделкой используйте тонкую пипетку или лабораторную салфетку для удаления лишней жидкости.

С помощью подогретой стеклянной пипетки аккуратно добавьте свежий расплавленный агрос вокруг ткани. Вносите коррективы в последнюю минуту до того, как агрос затвердеет, и не переполняйте колодец. Запишите номер образца, положив рядом небольшой пронумерованный листок бумаги.

После того, как все экземпляры будут залиты, разгладьте верхнюю поверхность геля, налив сверху тонкий слой арос. Используйте как можно меньше, чтобы гель оставался прозрачным для фотосъемки. После того, как гель затвердеет, его можно сфотографировать под стереомикроскопом, чтобы зафиксировать размер и форму каждой пары шариков и собрать морфометрические измерения для дальнейшего анализа.

Агаровые блоки, содержащие совпадающие пары шариков, можно вырезать из геля с помощью скальпеля или бритвенного лезвия. Затем они могут быть обработаны для гистологии парафина или криосекции стандартными методами. В качестве альтернативы отдельные шарики могут быть препарированы из агроса с помощью тонких игл, промытых в воде, а затем обработаны для других последующих применений, таких как иммуногистохимия или конфокальная микроскопия.

Наконец, весь гель можно запечатать в пакет и хранить на холоде. Экземпляры будут храниться в течение нескольких недель. Мы только что показали вам, как наблюдать и анализировать развивающуюся и восстанавливающуюся верхнечелюстную дугу.

Это новая система у рыбок данио, поэтому многое еще предстоит открыть. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.