一种用于绘制人pre-mRNA上核糖核蛋白（RNPs）结合位点的快速高通量方法

为了确定核糖核蛋白在前体mRNA上的结合位点，首先在目标前体mRNA的指定区域以30个核苷酸为窗口进行重叠排列，并将重叠的寡核苷酸合成到芯片上。将寡核苷酸从芯片上煮沸洗脱，并与目标RNP进行共沉淀。将起始总文库用SCI3标记，结合后的文库用SCI5标记，然后将两者共同杂交至检测芯片上。

随后对芯片进行扫描，并使用特征提取软件来解读结果。盐类。大家好，我是凯特·沃特金斯（Kate Watkins），来自布朗大学分子与细胞生物学系威尔·费尔兄弟（Will Fair brother）实验室。今天我将向大家展示一种快速且经济的方法，用于确定RNA-蛋白质复合物在实验室中预先合成的prem RNA上的精确定位，通过重新合成prem A作为一组重叠的寡核苷酸池来实现。

然后可通过共免疫沉淀将该复合物分离为结合组分和未结合组分，再通过微阵列进行分析。尽管该方法具有多种应用，我们主要利用它来研究多种剪接因子及其在选择性剪接中的作用。现在让我们开始吧。

开始此实验步骤时，使用 uc SC 基因组浏览器下载特定基因、剪接位点或其他感兴趣区域，用于设计 prem A 文库。选择感兴趣的区域，然后通过计算以 30 个核苷酸的读长和 20 个核苷酸的重叠进行连续覆盖，使每条寡核苷酸相对于前一条偏移 10 个核苷酸。在确定了这些 30 个核苷酸长度的寡核苷酸后，需在其两端添加通用引物序列。

将寡核苷酸提交至Agilent公司，用于定制寡核苷酸微阵列的制备。微阵列到货后，开始从其表面回收DNA寡核苷酸：将微阵列盖玻片放入杂交芯片盒中，轻轻吸取500 µL去离子水至玻片表面。将微阵列玻片正面朝下放置在盖玻片上方，使两张玻片的标签面相对，注意避免产生气泡，以免干扰寡核苷酸的回收过程。

关闭杂交室，并在杂交炉中于99摄氏度旋转过夜。次日，小心地从杂交室中取出芯片，吸除含有从芯片表面释放的寡核苷酸的液体。将释放的寡核苷酸混合物转移至1.5毫升离心管中，以50%的振幅进行超声处理，每次脉冲3至5秒，重复三次，以打散可能形成的团块。接下来，使用在其末端添加了T启动子的通用引物，通过低循环数PCR扩增该寡核苷酸混合物。

所需循环次数可能因寡核苷酸回收效率而异。避免过度扩增，过度扩增在聚丙烯酰胺凝胶上会表现为弥散条带。最后，使用Amon公司的mega short script试剂盒进行RNA转录。

通过苯酚-氯仿抽提RNA，随后使用乙酸钠和作为载体的糖蓝进行乙醇沉淀，以终止转录反应。将RNA沉淀重悬于105微升TE缓冲液中。准确测定RNA的浓度。

使用RiboGreen生成标准曲线，然后使用荧光酶标仪进行测量。RNA混合物现已准备好，可进行共免疫沉淀以开始拉下实验。

首先，通过将蛋白A和蛋白G磁珠按1:1的比例混合，制备磁珠，每反应体系终体积为50 µL。使用磁力分离架将磁珠集中于管底，以去除上清液。第二次洗涤后，用等体积的冷1×PBS洗涤两次。

重悬，将珠子重悬于等体积的预冷 XPBS 中，并加入两纳克抗体。该用量可能因抗体不同而有所变化，因此可能需要通过实验确定将抗体结合到珠子上的最佳条件。将混合物在 4°C 条件下于旋转平台上孵育过夜。

在早晨，每反应加入两微克超声处理的酵母总RNA，以阻断非特异性结合，并在四摄氏度下继续旋转孵育30分钟。阻断步骤完成后，再次使用磁力架去除上清液。随后用500微升冷的1×PBS洗涤磁珠两次，第二次洗涤后保留管中的PBS，将50微升磁珠混合物分装至新管中。

每个共免疫沉淀反应使用一个离心管。此时珠子已准备好用于共免疫沉淀。接下来，通过将RNA寡核苷酸文库与核细胞提取物混合，制备主混合液。

以RNP为来源，取50微升主混合液作为总样本，加入保护性引物。这些引物是通用引物的RNA版本，可防止蛋白质结合至引物序列或在RNA中引入二级结构。开始共免疫沉淀时，移除磁珠分装样品中的上清液，并将磁珠重悬于120微升剩余的主混合液中。在4°C条件下轻轻摇动反应体系1至2小时。

孵育结束后，可从小型Eloqua中取出包含珠子的少量样品用于后续各共沉淀样品的结合效率或特异性检测。如需进一步检测，将剩余反应体系置于磁力架上，移除上清液，并用预冷的1×XPDS缓冲液洗涤一至两次。

通过RNP与磁珠上抗体结合的RNA即为免疫沉淀（IP）样品。将IP磁珠重悬于50微升含1% SDS的0.1 XTE缓冲液中，65摄氏度加热15分钟。为洗脱RNA，收集上清液，其中含有先前结合在磁珠上的RNA，经苯酚-氯仿抽提后进行乙醇沉淀，再将沉淀物重悬于50微升0.1 XTE缓冲液中。

接下来，使用反向通用引物对样品进行逆转录。然后用通用引物对样品进行PCR扩增，其中一条引物应包含T7启动子。扩增文库所需的循环次数取决于共免疫沉淀的效率。

使用 Ambion 的 mega shorts 转录试剂盒再次转录样本，但此次加入两微升氨基烯丙基 UTP，替代试剂盒中提供的 T7 UTP。后续将利用氨基烯丙基 UTP 通过侧链标记 RNA。转录完成后。

使用苯酚氯仿抽提并用乙醇沉淀样品。请勿使用可能干扰样品与芯片杂交的糖蓝或乙酸铵。将沉淀重悬于4.5微升0.1摩尔碳酸钠溶液中。

首先对样品进行标记，向总样品中加入 2.5 µL 无核酸酶水。向免疫沉淀（IP）样品中加入 3 µL S3 和 3 µL SCI five。避光孵育一小时。

在室温下，向每个样品中加入六微升四摩尔的盐酸羟胺以终止反应，充分混匀后离心。在室温下短暂孵育15分钟，通过苯酚-氯仿抽提随后乙醇沉淀的方法纯化标记的样品。大部分颜色会随游离核苷酸进入有机相，因此沉淀物可能无明显颜色。

将每个沉淀重悬于50 µL的0.1 XTE中。按照Agilent芯片杂交试剂盒说明书制备微阵列样品，但需注意以下例外：添加断裂缓冲液后，立即加入杂交缓冲液以终止RNA断裂反应，不要对RNA进行片段化处理。

将样品置于芯片上，在50摄氏度下杂交三小时，同时芯片保持旋转。在50毫升锥形管中配制以下50毫升溶液：两管2倍浓度的SC缓冲液，两管1倍浓度的sea缓冲液，以及一管去离子水。

孵育三小时后，小心地打开芯片载玻片夹具，放入2×SSC缓冲液中。使用一对镊子，轻轻将芯片从盖玻片上分离。

轻轻取下盖玻片，注意不要触碰芯片。当玻片被抽出时，关闭锥形瓶并轻轻倒置 60 秒。使用镊子将芯片转移至 1×SSC 溶液中。

盖上管盖，轻轻颠倒混匀1分钟。然后将芯片转移至第二管XSSC溶液中，再次轻轻颠倒混匀1分钟。最后，将芯片转移至去离子水管中，轻轻颠倒混匀30秒。

将玻片边缘放在无尘纸上干燥。持续旋转玻片，注意不要触碰含有寡核苷酸的一侧。将芯片放入一个空的锥形管中，随后进行芯片扫描。

开始扫描芯片。以下是一个代表性芯片图示。每个特征点或寡核苷酸在总非富集文库中显示为绿色，在免疫沉淀富集文库中显示为红色。

每个特征点的信号被归一化为该通道的总强度。最终输出为红色通道与绿色通道的对数比值。在芯片的每个特征点上，每个基因组坐标的平均得分被映射到相应的位点。

以下以三个重叠的30个核苷酸寡核苷酸为例说明该平均步骤，其得分分别为2、4和0.5，图中显示了每个10个核苷酸窗口的平均富集得分。此处以CLTA基因上的多嘧啶区追踪结合蛋白PTB的结合模式为例，基因特征位于底部，PTP结合序列的对数平均富集得分由深红色垂直条形表示。浅红色条形表示PTP结合未富集的区域。

我刚刚向您展示了如何快速高效地构建一个覆盖特定目标区域（例如选择性剪接的轴突）的寡核苷酸文库。我们通常通过微阵列来分析这些文库，但也可以采用Illumina测序、Ion Torrent测序或更传统的Sanger测序方法进行测序。在进行该实验流程时，重要的是要记住，该文库的构建可在RNA或蛋白质水平上进行相应的修饰与调整。

在RNA水平上，可将自体区域、致病突变、多态性或随机突变引入寡核苷酸序列中。在蛋白质水平上，RNA结合因子可通过磷酸化或其他翻译后修饰进行修饰。此外，还可调控结合环境，以增加或减少与目标RNA结合蛋白竞争或相互作用的其他因子的水平。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。