Name: 라이브 해부 Drosophila 태아 : 항체 스테 이닝에 의해 돌연변이 컬렉션을 검사 늘씬한 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: 배우세요 Drosophila 태아의 라이브 해부 및 항체 스테이닝 방법을 통해 유전자 스크리닝 효율성을 높이는 기술입니다. 이 프로토콜은 발달생물학 및 신경과학 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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우리는이 프로토콜을 개발하기 위해 공헌 니키 폭스 Aloisia 슈미트 감사드립니다. 이 작품은 KZ, NS28182하는 NIH RO1 부여에 의해 지원되었다.

<ol><li>Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+and+other+cell+types+in+whole-mount+Drosophila+embryos+and+larvae+using+antibody+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes.</a> Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).</li>
<li>Desai, C. J., Gindhart, J. G., Goldstein, L. S., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+tyrosine+phosphatases+are+required+for+motor+axon+guidance+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Receptor tyrosine phosphatases are required for motor axon guidance in the Drosophila embryo.</a> Cell. 84, 599-609 (1996).</li>
<li>Sun, Q., Schindelholz, B., Knirr, M., Schmid, A., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+genetic+interactions+among+four+receptor+tyrosine+phosphatases+regulate+axon+guidance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Complex genetic interactions among four receptor tyrosine phosphatases regulate axon guidance in Drosophila.</a> Molecular and cellular neurosciences. 17, 274-291 (2001).</li>
<li>Schmid, A., Schindelholz, B., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+RNAi%3A+a+method+for+evaluating+the+functions+of+gene+families+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Combinatorial RNAi: a method for evaluating the functions of gene families in Drosophila.</a> Trends in neurosciences. 25, 71-74 (2002).</li>
<li>Fox, A. N., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heparan+sulfate+proteoglycan+syndecan+is+an+in+vivo+ligand+for+the+Drosophila+LAR+receptor+tyrosine+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The heparan sulfate proteoglycan syndecan is an in vivo ligand for the Drosophila LAR receptor tyrosine phosphatase.</a> Curr Biol. 15, 1701-1711 (2005).</li>
</ol>

우리는이 비디오 데모들은 지금 즉시 Drosophila 유전 발생학의 경험을 가진 사람에 의해 실행될 수있는 자료에 대해 충분하고 자세하게 사는 배아 해부와 얼룩을위한 방법을 표시했다 바랍니다. 물론, 상당한 연습은 여전히​​ 주로 해부 자신을 위해 필요합니다. 우리의 경험에서 라이브 절개 방법을 배우는 모든 사람이 그 / 그녀가 가장 빠르게 고품질의 못하였 느니라 해부를 생성할 수 있도록 갑자기 ... 다른 해부 프로토콜을 생성합니다. 이 과정은 전체 개발에 대한 개월이 필요합니다. 그러나, 대부분의 사람들은 연습을 몇 주 후에 고품질의 해부를 생성할 수 있습니다. 우리가 검사를 위해 살고 해부의 사용을 선호하지만 고정 해부 프로토콜은 배아 단계의 넓은 범위에 적용할 수 있기 때문에, 그들은 고정 해부를 대체할 수 없습니다. 예를 들어, 모터 축삭지도 phenotypes위한 DF 키트의 분석, 우리는 filopodia를 포함한 모터 축삭 지점,의 세부 사항은...

<table><tbody><tr><td>필라멘트 포함 붕규산 유리 관</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF120-60-10</td><td></td></tr><tr><td>Narishige 모델 PC-10 니들 풀러</td><td>Narishige International</td><td></td><td>가열 수준 58.9로 인발한 관</td></tr></tbody></table>

라이브 해부 drosophila 태아 : 항체 스테 이닝에 의해 돌연변이 컬렉션을 검사 늘씬한 방법

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

배아 발달의 단계 14 17 사이의 Drosophila의 배아는 쉽게 &quot;등심&quot;준비를 생성하기 위해 해부를하실 수 있습니다. 이러한 준비에서, 중추 신경 시스템은 중앙을 실행하고, 신체 벽 둘러싸인 있습니다. 여러 phenotypes는 그러한 준비를 사용하여 검사하고 있습니다. 대부분의 경우 필레는 항체 묻은 고정 전체 마운트 배아의 절개로 생성되었습니다. 이러한 &quot;고정 해부는&quot;그러나 일부 단점이 있습니다. 그들은 실행 시간이 소비되며,이 변이는 GFP 밸런서 염색체 이상 유지하는 주식에서 돌연변이 (GFP - 음수) 배아를 정렬하기가 어렵습니다. 2002 년부터, 우리 그룹은 고아 수용체에 대한 리간드를 식별 결핍 및 이소성 표현 화면을 실시하고 있습니다. 이 작업을 수행하기 위해서는, 우리가 사는 배아 해부하고 균형잡힌 라인의 수백을 포함하는 컬렉션의 항체 염색법에 대한 능률 프로토콜을 개발했습니다. 우리는 고정 절개로보다 라이브 절개로 주식의 대규모 컬렉션에 phenotypes을 검토하기 위해 상당히 더 효율적이라고 결론을 내렸다있다. 프로토콜 여기에서 설명한을 사용하여, 하나의 훈련 개인은 복합 현미경으로 각 라인 4-7 돌연변이 배아를 조사 phenotypes에 대해 하루에 10 라인까지 스크린 수 있습니다. 이렇게하면 한 줄에 최대 70 hemisegments가 40X 물 침지 렌즈 높은 배율의 점수이기 때문에 미묘한, 낮은 penetrance phenotypes를 부여 변이의 식별.

우리는 특정 genotypes의 Drosophila의 배아의 &quot;등심&quot;준비 창출을위한 능률적인 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 유전자 화면의 다양한 효율적인 실행을 허용합니다. 또한 후반 배아의 구조 우수 시각화 수 있습니다.

라이브 해부 Drosophila 태아 : 항체 스테 이닝에 의해 돌연변이 컬렉션을 검사 늘씬한 방법

배아 발달 단계 14에서 17 사이의 초파리 배아는 쉽게 해부하여 "필렛(fillet)" 표본을 제작할 수 있습니다. 이 표본에서...

여기서 배아를 수집하는 절차를 살펴보겠습니다. 바이알에서 파리를 꺼내 5구 수집 챔버의 튜브로 옮깁니다. 그다음 챔버 위에 포도 농업용 플레이트를 올리고 파리가 몇 시간 동안 알을 낳도록 둡니다.배아가 적절한 단계에 도달하면, 붓을 사용하여 그레이프 플레이트에서 양면 테이프로 옮깁니다. 이제 배아를 콘 밖으로 굴려 배측(ventral side)이 아래로 향하게 하여 한천 블록 위에 일렬로 세웁니다. 중앙을 보면 왁스 직사각형과 양면 테이프 조각이 부착된 슬라이드가 있습니다. 양면 테이프의 한쪽 끝을 배아가 늘어선 블록 위로 뒤집어 배아에 접촉시켜 슬라이드로 옮깁니다.이제 배아들이 즉시 등 쪽이 위로 향하게 됩니다. 왁스 사각형으로 둘러싸인 슬라이드 영역에 PBS를 추가하여 배아를 덮습니다. 위쪽은 슬라이드의 측면도이며 아래쪽은 평면도입니다.유리 해부침을 사용하여 난막(viel membrane)을 따라 절개합니다. 배아의 뇌 영역을 찔러 들어 올린 후, 유리판 위에 일렬로 배치합니다. 그 다음 각 배아를 해부하여 필레(filet) 형태로 만듭니다.절차가 끝나면 필렛 처리된 배아가 여러 줄로 배열된 슬라이드가 준비됩니다. 이제 고정 단계로 넘어갈 준비가 되었습니다. 안녕하세요, 저는 Caltech 생물학부 Kaizens 연구실의 포닥 피터 리(Peter Lee)입니다.안녕하세요, 저는 Caltech Kaizen 연구실의 대학원생 Ashley Wright입니다. 저는 Caltech의 교수인 Kaizen이며, 저희 연구팀은 초파리의 신경계 발달 연구를 수행하고 있습니다. 오늘은 살아있는 opal 배아를 해부하는 절차를 보여드리겠습니다.저희는 이러한 방법들을 사용하여 고아 수용체(orphan receptor) 리간드를 탐색해 왔습니다. 수용체 융합 단백질을 이용해 배아를 생체 염색함으로써, 세포 표면 단백질이 과발현된 세포주 컬렉션을 스크리닝하는 방식으로 이를 수행합니다. 또한 저희 연구실에서는 배아의 표현형을 연구하고 유전적 스크리닝을 실시하기 위해 이 절차를 사용하고 있습니다.저는 안내 표현형에 대한 운동 행동 결핍 스크리닝을 수행했습니다. 이제 시작하겠습니다. Peter가 구체적인 방법을 보여드릴 것입니다.먼저, 스패튤라를 사용하여 배아 수집 챔버의 각 배럴에 해당하는 포도 농업용 알 수집 플레이트에 효모 페이스트를 소량 도포합니다. 다음으로, 초파리 바이알에 이산화탄소 가스를 주입하여 초파리를 마취시킵니다. 수백

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Drosophila의 hemocytes은 개발 배아의 전체를 통해 분산. 이 프로토콜은 찬란 표시된 hemocytes와 배아를 사용하여 이러한 마이 그 레이션을 마운트 및 이미지하는 방법을 보여줍니다.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

성인의 준비 Drosophila</em씬 Sectioning 및 현미경 분석을위한> 눈

애벌레의, Pupal 및 성인의 해부 및 Immunohistochemistry<em&gt; Drosophila</em&gt; 망막

면역염색은 조직 내의 특정 세포 유형과 단백질을 시각화하는 효과적인 기술입니다. 초음파 처리를 활용함으로써, 여기에 설명된 프로토콜은 면역 염색 전에 후기 단계의 배아와 유충에서 Drosophila melanogaster 조직을 해부해야 할 필요성을 완화합니다. 우리는 포름알데히드가 고정된 전체 산 유충의 면역 염색을 위한 효율적인 방법론을 제공합니다.

늦게 단계 배아와 애벌레의 초음파 - 촉진 면역 형광 염색<em&gt; 초파리</em&gt; 조직<em&gt; 제자리에서</em

초파리의 성체 구조는 상상 원반이라고 하는 주머니와 같은 구조에서 파생됩니다. 이러한 디스크의 분석은 조직 결정, 구획 경계 설정, 세포 증식, 세포 운명 사양 및 평면 세포 극성을 포함한 많은 발달 과정에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 프로토콜은 광/형광 현미경 검사를 위해 가상 디스크를 준비하는 데 사용됩니다.

해부하고, 상상 디스크의 면역 염색에서 초파리

이 연구는 후기 단계 -16 Drosophila melanogaster 배아의 운동 뉴런 예측을 시각화하기위한 표준 면역 조직 화학 법을 상세히 설명합니다. FasII 항체로 염색 된 고정 배아의 필렛 된 준비는 신경 발달 중에 모터 축삭 돌연변이 및 표적인지에 필요한 유전자를 특성화하는 강력한 도구를 제공한다.

배아 운동 뉴런의 Axonal 투영 패턴의 시각화<em&gt; Drosophila</em

우리는 친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 운동 뉴런의 역행 추적방법을 기술한다.

친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 모터 뉴런의 역행 추적

여기서, 우리는 후기 배아 초파리 남성 생식선을 생생하게 이미지화하는 데 필요한 해부 프로토콜을 제공한다. 이 프로토콜은 정상적인 조건 하에서 또는 트랜스제닉 또는 약리학적 조작 후에 동적 세포 과정의 관찰을 허용할 것이다.

후기 배아 초파리 고나드의 해부와 라이브 이미징

이 프로토콜은 기존의 GFP/mCherry-tag 접근법을 사용하여 검출하기 어려운 저농도 단백질 또는 번역 후 변형의 실시간 이미징을 가능하게 하는 맞춤형 항체 기반 형광 라벨링 및 초기 초파리 배아에 주입하는 방법을 설명합니다.

형광 항체 주입을 통한 살아있는 초파리 배아의 저농도 단백질 및 번역 후 변형 시각화

이 연구는 참수, 고정, 동결 절제, 형광 염색, 면역 염색 및 이미징을 포함하는 조직 처리를 위한 단순화된 프로토콜을 제시하며, 이는 공초점 및 다광자 이미징으로 확장될 수 있습니다. 이 방법은 복잡한 해부에 필적하는 효능을 유지하며 고급 운동 기술의 필요성을 우회합니다. 정량적 이미지 분석은 광범위한 조사 잠재력을 제공합니다.

향상된 뇌 형광 염색 및 면역 염색을 위한 초파리 머리의 직접 동결 절편

이 글에서는 시약을 경제적으로 사용하고 소수의 상상 디스크를 쉽게 다룰 수 있는 효율적인 상상 디스크 해부 및 항체 염색 프로토콜을 설명합니다.

Drosophila melanogaster의 눈-더듬이 및 날개 상상 디스크의 소규모 해부 및 항체 염색

배우세요 Drosophila 태아의 라이브 해부 및 항체 스테이닝 방법을 통해 유전자 스크리닝 효율성을 높이는 기술입니다. 이 프로토콜은 발달생물학 및 신경과학 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

라이브 해부 Drosophila 태아 : 항체 스테 이닝에 의해 돌연변이 컬렉션을 검사 늘씬한 방법

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