Eine reversible, nicht-invasive Methode für Airway Resistance-Messungen und bronchoalveolären Lavage Sampling in Mäuse

Vor Beginn dieses Verfahrens wird der Geizhals mit intraperitoneal injiziertem Tomat anästhesiert. Die Tiere werden dann auf einen Tisch gelegt und ein 20-Gauge-Katheter wird oral in die Luftröhre eingeführt. Intubierte Mäuse werden an ein mechanisches Beatmungsgerät angeschlossen und ein intravenöser Zugang in der Schwanzvene begonnen.

Die Mäuse werden dann in einen Nagetier-SIGGRAPH eingeschlossen, der an zwei Druckmessumformern befestigt ist. Die Elektronik ermöglicht die kontinuierliche Messung des Widerstands der Atemwege während der Acetylcholin-Belastung. Nach dem Trennen des Beatmungsgeräts und des intravenösen Zugangs wird der Trachealkatheter in die linke Lunge vorgeschoben, die mit Kochsalzlösung gespült und durch den Katheter zurückgezogen wird.

Hallo, ich bin Simone Phar von der medizinischen Abteilung des Baylor College of Medicine. Heute zeigen wir Ihnen die orale Intubation von Mäusen, so dass die Atemwegsmechanik und die Flüssigkeit des Bronchovelärs wiederholt entnommen werden können. Wir verwenden dieses Verfahren, um experimentelle allergische Erkrankungen zu untersuchen, die ein experimentelles Modell von Asthma sind, und dieses Verfahren kann auch auf andere Anwendungen übertragen werden.

Also lasst uns loslegen. Zu Beginn dieses Verfahrens wird die Maus durch eine intraperitoneale Injektion von 48 Milligramm pro Kilogramm Ate tief betäubt. Die Maus wird dann in ein weiches Lichtfeld gelegt, um sie ruhig zu halten.

Hierfür kann ein sauberer Mäusekäfig verwendet werden, der mit einem Tuchtuch bedeckt ist: Nach fünf bis 10 Minuten wird durch eine Zehenkneifung bestätigt, dass das Tier vollständig betäubt ist und dann in die liegende Position gebracht. Mit der Bauchseite nach oben auf einem kleinen Tisch, der in einem 45-Grad-Winkel eingestellt ist. Um das Motiv an Ort und Stelle zu halten, führen Sie ein Gummiband ENC ein, das den Tisch hinter der oberen Zahnreihe umkreist.

Eine Wärmelampe sollte verwendet werden, um die Maus mit der rechten Hand warm zu halten. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Zunge aus dem Mund zu greifen, zu strecken und zu heben. Führen Sie dann vorsichtig einen Zungenspatel aus Metall ein, den Sie in Ihrer linken Hand halten.

Dies ermöglicht einen ungehinderten Atemweg und eine Visualisierung der Stimmbänder für die Intubation. Führen Sie als Nächstes einen Glasfaserfaden mit einem Durchmesser von 0,8 Millimetern, der mit einer Lichtquelle verbunden ist, durch den Angio-Katheter ein und verlängern Sie ihn 10 Millimeter über die Spitze hinaus. Während Sie den Depator mit der linken Hand untersuchen, führen Sie mit der rechten Hand das beleuchtete Ende des Glasfaserfadens durch die Mundhöhle und den Rachen, bis die Stimmbänder sichtbar sind.

Führen Sie dann unter direkter Visualisierung und Timing mit dem Zeitpunkt, an dem die Stimmbänder maximal geöffnet sind, den Faden durch die sich bewegenden Stimmbänder und in die Luftröhre. Führen Sie nun den Angio-Katheter über den Glasfaserfaden in die Luftröhre ein, bis die Katheterspitze im mittleren Teil der Luftröhre liegt. Bei einer 17 bis 22 Gramm schweren Maus entspricht dies einem 10 Millimeter großen Kathetersegment, das außerhalb des Mundes verbleibt.

Entfernen Sie den Glasfaserfaden, um eine erfolgreiche Intubation zu bestätigen. Beobachten Sie regelmäßige, tiefe Atemzüge, die nach dem Verschluss des Verbindungsstücks mit dem Daumen sofort enden. Senken Sie den Plethysmographentisch ab, bis er parallel zur Werkbank ist, und drehen Sie das Motiv um 180 Grad, bis es der Öffnung des Beatmungsgeräts zugewandt ist.

Drehen Sie das Tier auf die Seite, bevor Sie es an das Beatmungsgerät anschließen. Sichern Sie eine luftdichte Verbindung und aktivieren Sie das Beatmungsgerät. Eine erfolgreiche Intubation wird weiter bestätigt, wenn man später sieht, dass die Raso-Abdominalexkursion mit dem Beatmungsgerät Schritt hält.

Um die Nadel für den intravenösen Zugang vorzubereiten, entfernen Sie eine 10-Millimeter-Nadel mit 27 Gauge aus dem Spritzenanschluss und biegen Sie sie in der Mitte um 90 Grad, so dass die Abschrägung in den Winkel zeigt. Verbinden Sie das nicht abgeschrägte Ende mit dem PE 10-Schlauch, der zum IV-Injektionsanschluss führt. Um eine potenziell tödliche Luftembolisation zu verhindern.

Spülen Sie den Schlauch und die Nadel mit 37 Grad Celsius 0,9% Natriumchlorid über die Ein-Milliliter-Spritze. Die Injektionsöffnung besteht aus einer 27-Gauge-Nadel, die durch ein Loch geschoben wird, das in den Deckel eines 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchens gebohrt wurde. Die Kappe ist mit Kochsalzlösung gefüllt, so dass das Ende der Nadel ständig untergetaucht wird, wodurch die Wahrscheinlichkeit verringert wird, dass die Luft in die Nadel eingeschlossen und intravenös injiziert wird.

Richten Sie die Nadel am codalen Ende des Schwanzes aus. Parallel zur und über der Vena lateralis. Führen Sie die Nadel leicht unter die Haut, während Sie sie richten.

Schädel entlang der Venenlänge und subkutan bis zur Biegung drückend. Um die erfolgreiche Platzierung der Infusion zu bestätigen, ziehen Sie leicht am Spritzenkolben. Sie sollten einen Blutrückfluss in den Infusionsschlauch sehen.

Darüber hinaus sollte bei Injektion von 50 bis 100 Mikrolitern Kochsalzlösung in die Schwanzvene ein ungehinderter Fluss durch den Infusionsschlauch erfolgen. Nachdem Sie die Wärmelampe aus dem Setup genommen haben, schließen Sie das Motiv in das Plasmodiagramm ein und befestigen Sie es mit vier Klemmen luftdicht. Das Entfernen der Wärmelampe ist wichtig, um eine Erwärmung der Luft in der Plasmo-Graphenkammer zu verhindern und möglicherweise nachfolgende Messungen des Atmungssystemwiderstands oder RRS zu verändern. Der Atmungssystemwiderstand oder RRS wird durch kontinuierliche Quantifizierung des Quotienten bestimmt.

Änderung des Atemwegsdrucks über den Luftstrom oder des Deltas P über V an Punkten mit gleichem Lungenvolumen. Delta P wird mit Hilfe eines Druckwandlers bestimmt, der mit dem Tracheal-Angio-Katheter V verbunden ist. Die Differenz des Plasmatransplantatvolumens über die Zeit wird vom Vorverstärkermodul berechnet. Nach Etablierung einer stabilen Baseline injiziert RRS fünf aufeinanderfolgende Dosen mit steigenden Konzentrationen von Acetylcholinchlorid oder einem CH über eine Sekunde über die i.v.

Jede nachfolgende Dosis wird nach Rückkehr des RRS zum Ausgangswert verabreicht, bis ein Anstieg des Atemwegswiderstands um 200 % erreicht ist. Entfernen Sie die Infusion aus der Schwanzvene und trennen Sie die Maus vom Beatmungsgerät. Halten Sie die Atemwege offen, indem Sie die Trachealkanüle an Ort und Stelle halten, und stellen Sie sicher, dass die Maus die Spontanatmung wieder aufgenommen hat.

Ist dies nicht der Fall, kann die Atmung durch sanftes Massieren des Brustkorbs gefördert werden. Sobald die Maus die Spontanatmung wieder aufgenommen hat, bringen Sie sie mit einer Trachealkanüle in eine Kammer, die mit 100 % Sauerstoff gespült und mit der Wärmelampe auf 37 Grad Celsius gehalten wird. Die Trachealkanüle muss an Ort und Stelle bleiben, bis das Tier wach ist, um einen erstickungsbedingten Tod durch Acetylcholin-induzierte Hypersalivation zu verhindern.

Bronchoalveoläre Lavage oder BAL-Flüssigkeit kann erst entnommen werden, wenn die Maus ihren Würgereflex ausreichend wiederhergestellt hat, was etwa 20 Minuten nach dem Austausch in der Erholungskammer auftreten sollte. Um den Würgereflex zu beurteilen, schieben Sie den Angio-Katheter vorsichtig nach innen und außen, offensichtliches Husten oder Kämpfen deutet darauf hin, dass der Würgereflex zurückgekehrt ist, um BAL-Flüssigkeit zu sammeln. In den Angio-Katheter wird ein metallischer Intubationsführungsdraht mit einer durchgehenden Biegung von etwa 30 Grad, der auf den linken Lungenlappen gerichtet ist, eingeführt.

Schieben Sie den G-Draht und den Angio-Katheter zusammen in den linken Lungenlappen vor, so dass die ausgeschlossene Katheternabe nur einen Millimeter über die Frontzähne hinausragt. Stellen Sie sicher, dass die Spitze des G-Drahtes nicht durch das offene Ende des Angio-Katheters führt. Um eine Trachealverletzung oder -ruptur zu vermeiden, während der Angio-Katheter an Ort und Stelle bleibt, spülen Sie unmittelbar danach 300 Mikroliter steriles PBS pH 7,4 über eine Ein-Milliliter-Spritze in die linke Lunge, während Sie den Spritzenkolben aufziehen.

Um einen Unterdruck zu erzeugen, entfernen Sie den Angio-Katheter langsam, während Sie die Lunge intensiv massieren. Es wird eine BAL-Rückgabe von 100 bis 200 Mikrolitern erwartet. Bringen Sie die Lavamaus sofort wieder in die 37 Grad Celsius heiße Kammer mit 100 % Sauerstoff.

Legen Sie das Tier auf die linke Seite, bis es sich etwa 20 Minuten lang vollständig erholt hat, und setzen Sie es dann wieder in seinen Käfig. Wir präsentieren hier repräsentative Ergebnisse von Atemwegswiderstandsmessungen, Atemwegshyperreaktivität, definiert als RRS-Werte, die bei jeder Acetylcholin-Dosis signifikant höher sind als bei naiven Werten, die nach fünf Allergenprovokationen bei der vierten Dosis entwickelt wurden. Nach der sechsten Herausforderung wurde jedoch eine viel größere Hyperreaktivität der Atemwege beobachtet, ohne dass die Reaktionsfähigkeit weiter zunahm.

Bei der siebten Challenge wurde eine CH-Dosierung gestoppt, nachdem sich die RRS-Werte gegenüber den Ausgangswerten verdreifacht hatten, weitere Dosierungserhöhungen führen sonst zu letalem Bronchospasmus. Mäuse, die wiederholt mit einem intranasalen Vehikel konfrontiert wurden, um keine Hyperreaktivität der Atemwege zu entwickeln, und bei allen Dosen eines CH unterhielten RRS-Messungen variierten nicht signifikant von den Ausgangswerten, wie diese repräsentativen Echtzeit-RRS-Aufzeichnungen einer naiven und sechs x allergenbelasteten Maus zeigen, die vor dem Auftreten einer robusten A-HR aufeinanderfolgende intravenöse Dosen eines CH erhielt. Das dominante Zellband der Atemwege, das durch das Allergen induziert wurde, war das Neutrophile, ähnlich dem Trend bei einer HR. Die Eosinophilie verstärkte sich jedoch allmählich mit wiederholter Allergenprovokation und der Eosinophile wurde zum numerisch dominierenden Zelltyp in der BAL-Flüssigkeit. Nach der sechsten Challenge fiel dies mit einem deutlichen Rückgang der Neutrophilenzahlen zusammen.

In der Kontrolle forderte PBS Mäuse heraus. Auch die Messungen des Atemwegswiderstands variierten im Laufe der Zeit nicht signifikant. Eine erhöhte Makrophagenrekrutierung von Neutrophilen, aber nicht von Eosinophilen zur BAL-Flüssigkeit wurde bei diesen Mäusen ebenfalls beobachtet, ähnlich wie bei Mäusen, die nur wiederholte BAL-Flüssigkeitsproben erhielten.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie Mäuse reversibel oral intubieren und auf den intravenösen Zugang zugreifen können, um physiologische Daten der Atemwege und bronchoalveoläre große Flüssigkeit zu sammeln. Bevor Sie diese Techniken an lebenden Tieren anwenden, ist es wichtig, jede Technik einzeln zu üben und zu perfektionieren. Von kränkelnden Tieren.

Eine strenge und schonende Handhabung ist unerlässlich und es muss jederzeit eine strenge aseptische Technik durchgeführt werden. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.