Studeren Synaptic Blaasjes zwembaden met behulp van Photoconversion van styrylkleurstoffen

Deze video demonstreert de procedure voor fotoconversie van Styro Dye FM 1 43. Om synaptische blaasjespools in drosophila melanogaster te bestuderen, worden eerst drosophila-larven gedisseceerd om de ventrale spieren bloot te leggen, welke de neuromusculaire junctie of NMJ-preparatie vormen. De preparaten worden geïncubeerd in een buffer die FM D bevat, hier in het grijs weergegeven, ter markering van het cellulaire membraan.

Vervolgens worden ze elektrisch of chemisch gestimuleerd om fysieke fusie te induceren, waarna vesikelmembranen worden geïnternaliseerd. Gestimuleerde exocytose zal worden gekleurd met FM D. De extracellulaire FM-kleurstof wordt vervolgens weggewassen om deze van het plasmamembraan te verwijderen, waarna het weefsel wordt gefixeerd onder continue hoogintensieve verlichting. De kleurstof wordt volledig gebleekt en de zwarte kleur verschijnt door neerslag van diaminobenzidine.

Dit neerslag kan vervolgens worden gevisualiseerd met transmissie-elektronenmicroscopie. Hallo, ik ben Philippe o Paso van het laboratorium van Sylvia Olli aan het European Neuroscience Institute in Gaon, Duitsland. Vandaag laten we u een procedure zien voor FM-fotoconversie in de neuromusculaire overgang.

We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de recycling van synaptische blaasjes te bestuderen. Laten we beginnen. Werk onder een dissectiemicroscoop. Begin met het vastpinnen van een Drosophila-larve met de dorsale zijde naar boven in een schaal gecoat met agarose.

Bedek het met drosophila-zoutoplossing met behulp van een injectienaald en maak met een dissectieschaar een longitudinale incisie langs de dorsale zijde. Verwijder vervolgens de inwendige organen. Rek daarna het preparaat uit en zet het opnieuw vast op de petri-schaal met spelden.

Verschillende ventrale spieren kunnen vervolgens worden gebruikt om de in deze procedure gebruikte FM-kleurstoffen te beschermen tegen bleken. Deze procedure moet onder omstandigheden met weinig licht worden uitgevoerd. Bedek het geklemde drosophila-preparaat met drosophila-zoutoplossing die 90 millimolar kaliumchloride en 10 micromolar FM.1 43 bevat om de zenuwen chemisch te stimuleren.

Incubeer gedurende één minuut bij kamertemperatuur na de stimulatie. Verwijder de stimulerende oplossing en dompel het schaaltje met de gepinde drosophila-preparaat twee keer onder in een bekerglas gevuld met 100 milliliters drosophila-saline om de extracellulaire FM 1 43-kleurstof te verwijderen, terwijl u werkt onder een chemische afzuigkap.

Fixeer het neuromusculaire junctiepreparaat in 2,5% glutaaraldehyde in fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. Was het preparaat één keer met PBS, haal het vervolgens uit de schaal en dompel het 15 minuten onder in 100 millimol ammoniumchloride om de vrije aldehydegroepen van het resterende glutaaraldehydefixatief te neutraliseren.

Was de ammoniumchloride-oplossing met normale PBS, plaats de neuromusculaire junctie-preparatie in een nieuwe cigar dish en dompel deze onder in gefilterde 1,5 mg/mL diaminebenzidine of DAB in PBS en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C. Positioneer het monster onder een fluorescentiemicroscoop die is uitgerust met een kwiklamp als lichtbron, met een lamphuis dat een achterspiegel bevat, gebruikmakend van een droog objectief met een relatief lage vergroting.

Zoek het monster. Breng vervolgens het fluorescentiesignaal in focus met behulp van een standaard blauwe excitatie/groene fluorescentie-filterkubus. De neuromusculaire overgangen verschijnen als heldere vlekken op de spieren.

Belicht vervolgens het monster met dezelfde fluorescentiefilterset op maximale intensiteit totdat de FM D volledig is gebleekt. Met een 20 x objectief zouden 30 tot 45 minuten voldoende moeten zijn. De tijd voor fotoconversie varieert echter afhankelijk van de belichtingsintensiteit, de penetratiekracht van DAB in het preparaat en het gebruikte objectief.

Onderzoek het monster na belichting onder transmissielicht. Indien er fotoconversie heeft plaatsgevonden, zou een donkerbruin precipitaat zichtbaar moeten zijn. Keer terug naar de dissectiescoop en gebruik vervolgens een schaar om de gefotoconverteerde plek uit de larve te knippen.

Keer terug naar de dissectiescoop. Gebruik vervolgens een schaar om de gefotografeerde plek uit de larven te knippen. Plaats de monstername nu in een microcentrifugebuis met PBS, terwijl u werkt onder een chemische zuigkast en de juiste veiligheidsuitrusting draagt, inclusief handschoenen en oogbescherming.

Bereid per monster 300 µL 1% osmiumtetroxide voor. Plaats het monster vervolgens in een glazen fles met plastic dop en voeg de bereide osmiumtetroxide-oplossing toe om de preparatie te postfixeren. Terwijl het monster incubeert, worden aparte oplossingen bereid met 30, 50, 70, 90, 95 en 100% ethanol.

Was het monster vier tot vijf keer met PBS gedurende vijf minuten per keer. Gebruik na elke wasbeurt een plastic PE-tip op uw pipet om het monster over te brengen naar een nieuwe kolf. Breng het monster na de laatste wasbeurt over naar een schone glazen kolf.

Dehydrateer vervolgens het monster door het in de reeks ethanoloplossingen te plaatsen. Begin met incuberen in 1 mL 30% ethanol. Verwijder na vijf minuten de ethanol met een pasteurpipet en vervang deze door 1 mL 50% ethanol.

Ga verder met de dehydratie door het preparaat van de neuromusculaire overgang te incuberen in 70%, 90% en vervolgens 95% oplossingen. Het monster wordt daarna twee keer geïncubeerd in een 95% ethanoloplossing, gevolgd door drie incubaties in 100% ethanol na de dehydratie. Voeg twee milliliters van een een-op-een EIN-hars in ethanol toe en plaats het monster op een rotatie-incubator.

Twee tot vier uur bij kamertemperatuur na rotatie bij 100%ein en plaats het monster in een open fles om de resterende ethanol gedurende vier tot zes uur te laten verdampen. Giet verse EIN in een mal. Voeg de preparaten toe en incubeer bij 60 °C gedurende 36 uur.

Wanneer de in EIN ingebedde preparaten gereed zijn, gebruik dan een ultramicrotoom om met een diamantmes coupes van 50 tot 80 nanometer dik voor te bereiden. De monsters worden in dunne coupes gesneden. De coupes drijven op het waterbad van het mes en kunnen vervolgens worden opgepikt op normale EM-grids.

De preparaten zijn nu klaar om te worden afgebeeld met behulp van conventionele EM-procedures. Geïsoleerde neuromusculaire juncties van Drosophila Melan gaster werden gestimuleerd met een hoge concentratie kalium, en geïnternaliseerde membranen werden gekleurd met FM 1 43 zoals hier wordt getoond.

De fluorescentie van een zenuwuiteinde kan worden waargenomen met een conventionele epifluorescentiemicroscoop. Bij continue belichting wordt de kleurstof volledig gebleekt en wanneer de belichting aanhoudt, verschijnt er een zwarte kleur door precipitatie van dinobenzine. Dit zenuwuiteinde bevat synaptische blaasjes, maar geen van deze zijn gefotoconverteerd.

Dit kan worden veroorzaakt door onvoldoende belichting of een slechte penetratie van DIA-aminobenzeen in het weefsel. Daarentegen leidt te veel belichting tot een algehele donkere terminal waarbij geen blaasjes of organellen meer te onderscheiden zijn; met de juiste hoeveelheid belichting is fotoconversie zichtbaar. Deze micrografie toont een synaptische knop waarin een verzameling donkere blaasjes te zien is, wat duidt op FM-fotoconversie.

We hebben zojuist gedemonstreerd hoe synaptische blaasjes die gelabeld zijn met fem-kleurstof fotochemisch kunnen worden omgezet. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de belichtingstijden voor de conversiestap altijd zorgvuldig moeten worden gekalibreerd. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken. Veel succes met uw experimenten.