Name: Vomeronasal 상피의 Multielectrode 배열 레코딩 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-01T16:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 학습하세요 생쥐 VNO에서 다중전극 배열을 이용한 전기생리학 기록 방법을. 로봇 암을 활용한 정밀 자극으로 후각 신경 처리 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

우리는 성령 연구소의 회원을 감사드립니다. 이 작품은 청각 및 통신 장애에 대한 국립 연구소 (R01 DC005964로)와 NSF IGERT 0548890 (하)에 의해 지원되었다. 동물 실험은 미국 동물 복지 행위 및 건강 지침 국립 연구소에 따라 수행되었으며 워싱턴 대학 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1 부. 전기 녹음 계측 <ol><li> 우리는 실리콘 질화물과 절연 10 μm의 평면 티타늄 질화물 전극과 평면 multielectrode 배열을 (에이러 과학 악기)을 사용합니다. 60 전극 30 μm의 중심 - 투 - 중심 간격 5x6 격자로 이루어진 두 분야로 정렬됩니다. (다른 구성도 가능합니다, 직경 녹음 표면에 10 μm의와 전극은 단일 뉴런의 활동을 격리의 관점에서 큰 전극보다 수 있습니다.) </li><li> 전기 신호는 MEA 1,060 앰프 (에이러 과학 악기)를 사용 (1000x 증폭) 증폭됩니다. 신호는 데이터 수집 카드 (내쇼날 인 스트 루먼트) 및 사용자 정의 데이터 수집 소프트웨어 (하나도 상용 소프트웨어를 구입할 수 있습니다)를 사용하여 10 kHz에서에서 찾았습니다. </li><li> 조직은 MEA의 문화 관 반지 안쪽 snugly 맞는 사용자 정의 삽입에 연결된 나일론 메쉬 (53 μm의)에 의해 MEA 아래로 개최됩니다. </li></ol> 2 부. 액체 배달 계측 <ol><li> 조직은 우리가 링어의 솔루션 (115 MM 나트륨 염화물, 5 MM 염화칼륨, 2 MM의 염화칼슘, 2 MM 마그네슘 염화물, 25 MM 나트륨 중탄산염, 10 MM HEPES, 10 MM D - (+를 제공하여 보증 지속 superfusion을 필요로 HPLC 펌프에서) - 포도당). 자극은 HPLC 밸브에 주입을 수행하고 -를 통해 흐름과 루프 사이의 전환에 의해 제공됩니다. HPLC 펌프 및 사출 로봇 주사기 펌프 모두 링어의 솔루션을 제공하고 있습니다. </li><li> 링어의 솔루션은 실험을하는 동안 42 온수 물을 욕조 (ISOTEMP 105) ° C에 보관하고 지속적으로 95% O 2 / 5% CO 2와 함께 부풀어 오른 모양이다. 포도당없이 링어의 별도의 플라스크는 주사기 펌프를 백업을위한 준비가되어 있습니다. 링어의 솔루션은 3 ML / 분 속도로 307 HPLC 펌프 (길슨)를 사용하여 조직에 배달됩니다. 전형적인 5~6시간 실험에서 각 링어의 솔루션 1 L은 충분합니다. </li><li> 실험을하는 동안, 조직은 지속적으로 37 ° C 링어의 솔루션을 superfused입니다. 히터 프로브 직접 조직 위에 위치합니다. </li><li> 자극은 길슨 215 액체 처리기 로봇 팔을 사용하여 전달됩니다. 자극은 고무 덮인 유리 튜브에 저장하고, 일정한 유속과 압력이 유지되는 동안 길슨 소프트웨어의 통제, 로봇 팔 재관류 라인에 자극을 제공하고 있습니다. </li><li> HPLC 밸브 (루프 약혼 / 약혼하지 않음)의 상태의 연결 활동으로 동기화를 보장하기 위해 별도의 채널로 수집 컴퓨터에 의해 기록됩니다 전기적 전압으로 표시됩니다. </li></ol> 부 3. MEA와 자극 전달 장치를 준비 <ol><li> 전에 절개를 수행하기 위해 상온에서 최소 5 분 dH2O의 BSA와 잘 MEA를 입력합니다. </li><li> 따뜻한 - 부풀어 오른 링어의 솔루션을 사용하여 MEA를 씻어 얼음에 MEA를 놓으십시오. </li><li> 프라임 액체 처리기와 HPLC는 제조 업체의 지시에 따라 펌프. </li></ol> 부 4. VNO의 해부 <ol><li> 절개를 수행하기 전에, 얼음에 부풀어 오른 링어의 솔루션 및 장소 2 60x15 mm 배양 접시를 입력하십시오. 또한 얼음 링어의 솔루션과 장소에서 동일한 크기의 2 Sylgard 코팅된 배양 접시를 입력하십시오. 해부하는 동안 사용하기 위해 따뜻한 부풀어 오른 링어의 추가 50mL를 풀어. </li><li> 마우스는 자궁 전위 다음 CO 2 질식을 통해 희생이다. </li><li> 머리의 뒤쪽에, 턱 라인에 평행하게 실행 입의 측면에서 양국 incisions하십시오. 목 뒤에 따라 2 상처에 참여하고 마우스에 부착된 아래턱을두고, 머리 등의 부분을 제거합니다. </li><li> 좋은 가위를 사용하여 조직과 뼈가에서 조직을 분리 위턱 뼈의 양쪽 사이 했네요. </li><li> 비강을 폭로하는 미각의 조직에서 껍질, # 3 포셉을 사용합니다. </li><li> 작은 가위 또는 뼈를 vomeronasal 캡슐을 무료로 사이의 상단이 앞니의 양쪽에 상처 메스를 사용합니다. </li><li> # 3 포셉을 사용하여 얼음에 페트리 접시에있는 평면 골과 장소로 vomeronasal 캡슐을 선택합니다. 최대 집중을 통해 단계는 3보다 분 이내에 수행되어야합니다. </li><li> 반사광과 조명 stereomicroscope 아래 접시를 놓으십시오. # 3 포셉를 사용하여 한 번에 한 VNO에서 뼈다귀 캡슐을 제거합니다. , 멀리 VNO에서 뼈 껍질에 꼬리 끝 및 다른 손에서 재밌 VNO을 손상하지 않도록주의를 취하여 뼈에 캡슐을 안정화시키기 위해 한 손으로를 사용합니다. </li><li> 뼈가 제거되면 Sylgard 코팅 페트리 접시에 VNO을 전송하기만하면됩니다. 다른 VNO에 대해 남아있는 요리를 사용합니다. 전송 빛을 조명을 전환합니다. </li><li> 마이크로 가위 또는 # 5 포셉를 사용 VNO의 가장자리 절단하여 혈관에서 VNO를 구분한다. 이 시점에서 당신 것입니다완전히 혈관에서 분리 신경 시트 수 있습니다. </li><li> 내부 (돌기) 측면까지 함께 VNO를 놓습니다. # 3 포셉 사용하여 조직의 모서리에있는 Sylgard에 VNO를 앵커. 클램프와 함께 개최되는 테플론 코팅 면도날의 작은 조각을 사용하여 기초 라미나에서 신경 상피 껍질. 얕은 각도 (&lt;30 ° 그릇 표면에서)에서 칼날을 개최하는 것이 가장 좋습니다. </li><li> 유리 피펫을 사용하여 MEA로 요리에서 신경 상피의 조각을 전송합니다. 최대 돌기 면을 전극 필드 위에 VNO를 놓습니다. 피펫과 초과 링어의 솔루션을 제거합니다. 장소에 VNO를 개최하고, 냉장 링어의 솔루션을 작성하기 위해 배열의 잘에 메쉬 조직 홀더를 놓습니다. </li></ol> 제 5 부. 녹음 <ol><li> MEA 1,060 증폭기의 MEA를 삽입하여 직접 조직 위의 히터 프로브를 위치. </li><li> 적절한 히터 프로브 위치를 확인하려면, 링어의 솔루션은 2 초 50 MM의 칼륨을 (몰 나트륨에 대한 대체) 포함과 자극. 칼륨 용액에 신경 응답의 지연 시간을 최소화하기 위해 위치를 조정합니다. </li><li> 이전에 조직이 적응 수 있도록 녹화 45 분 1 시간 온수 링어의 솔루션으로 조직을 Superfuse. </li><li> 전기 신호는 사용자 정의 레코딩 소프트웨어를 사용하여 디스크에 저장됩니다. </li></ol> 6 부. 데이터 분석 <ol><li> 오프라인 데이터 분석은 원시 전극 기록을 사용하여 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 특정 리간드에 대한 응답으로 기록된 세포의 발사 속도 변화를 측정합니다. 그 결과 데이터 세트는 대형이며, 다양한 질문을 해결하는 데 사용할 수있는, 프로그래밍이나 분석 언어 (C, Matlab, R, 파이썬, 또는 이와 유사한 것)과 친숙이 필요합니다. </li></ol> 7 부. 대표 결과 이 준비는 일반적으로 데이터 (60 전극에서 기록 6 시간)의 대량 항복, 6 시간 동안의 기록 정도로 안정됩니다. <img src="/files/ftp_upload/1845/1845fig1tmb.jpg" alt="그림 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 배열의 절반에 걸쳐 동시 활동의 스냅샷이 표시됩니다. 시간 창 400 MS에 걸쳐. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1845/1845fig1.jpg">여기를 클릭</a> 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1845/1845fig2tmb.jpg" alt="그림 2" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 전형적인 실험에서는, 우리는 10 초 동안 관심의 특정 화합물과 자극. 이 추적은 100 배 희석 여성 마우스 소변에 대한 응답의 예입니다. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1845/1845fig2.jpg">여기를 클릭</a> 그림 2의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

<ol><li>Dulac, C., Torelo, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+detection+of+pheromone+signals+in+mammals%3A+from+genes+to+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour.</a> Nat Rev Neurosci. 4, 551-562 (2003).</li>
<li>Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+Vomeronasal+neurons+to+natural+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Responses of Vomeronasal neurons to natural stimuli.</a> Science. 289, 1569-1572 (2000).</li>
<li>Nodari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulfated+steroids+as+natural+ligands+of+mouse+pheromone-sensing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sulfated steroids as natural ligands of mouse pheromone-sensing neurons.</a> J Neurosci. 28, 6407-6418 (2008).</li>
</ol>

Multielectrode 배열 레코딩은 우리에게 뉴런의 큰 인구의 동시 활동을 모니터링하는 능력을 허용합니다. 이것은 특히, VNO를 감각 시스템의 속성을 탐색을위한 유용한 도구입니다. 메인 후각 시스템과는 달리, VNO는 액상의 자극을 감지합니다. 또한, VNO는 이질적인 조직이다. 아마도 다른 응답 프로필 마우스 1 수용체의 약 300 종류가 있습니다. 로봇 팔을와 결합된 MEA 레코딩은 우리가 안정적으로 뉴런과 electrophysiologically 정체성 응답의 크고 다양한 인구 액체 자극을 제공할 수 있습니다. 또한, 체외에서 VNO의 안정성은 자극의 여러 반복을위한 시간을 허용합니다. 이전,이 기술은뿐만 아니라 소변 3 현재 각 리간드를 확인하는 신뢰할 수있는 분석의 역할로 2 마우스 소변에 대응 VSNs의 감각 특성을 조사하기 위해 사용되고 있습니다. 앞으로이 기술은 고도로 추가 리간드...

vomeronasal 상피의 multielectrode 배열 레코딩

Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

신경 회로를 이해하는 것은 방법이 동시에 여러 뉴런에서 기록해야합니다. 에<em&gt; 체외에서</em&gt; 연구 하나의 현재 사용 가능한 기술은 평면 multielectrode 배열 (MEA) 기록입니다. 여기 수용체의 유형의 수백을 표현하는 감각 뉴런의 다양한 인구를 통해 페로몬과 사회적 단서의 검색에 필수적인 역할을 마우스 vomeronasal 기관 (VNO)을 공부하기 MEAs의 사용을 문서. 화학 자극을 제공하는 로봇 액체 처리기와 MEA의 녹음을 결합, 뉴런의 크고 다양한 인구의 감각 반응이 기록하실 수 있습니다. 준비는 우리가 마우스에서 VNO의 손상 neuroepithelium를 제거하고 몇 시간 동안 뉴런의 전기 활동을 모니터링하면서 화학 물질이나 잠재적인 리간드의 배터리와 자극 수 있습니다. 따라서이 기술은 리간드의 활동을 평가뿐만 아니라 수용체 뉴런의 속성을 탐험을위한 유용한 방법으로 제공하고 있습니다. 우리는 vomeronasal 상피, MEA 녹음, 화학 자극을 준비하는 데 필요한 기술을 제시한다.

Multielectrode 어레이 (MEA) 녹음 뉴런의 대규모 인구의 전기적 활동을 연구하는 방법을 제공합니다. 여기, 우리는 동시에 조직을 자극하는 동안 마우스 vomeronasal 상피에서 기록 MEA 준비의 세부 사항을 제시한다.

Vomeronasal 상피의 Multielectrode 배열 레코딩

신경 회로를 이해하기 위해서는 많은 수의 뉴런으로부터 동시에 기록할 수 있는 방법이 필요합니다. 인 비트로(in vitro) 연구를 위해 현재 사용 가능한 기술 중 하나는 ...

평면 다중 전극 어레이를 사용하여 UL 비기관의 신호를 기록합니다. 신경 상피가 손상되지 않도록 마우스에서 VNO를 적출합니다. 먼저, 마우스에서 VNO 캡슐을 제거합니다.그런 다음 골 캡슐, 혈관 및 기저판으로부터 신경 상피를 분리합니다. 조직의 수지상 결절 부위가 위를 향하도록 하여 MEA에 배치합니다. 설정이 완료되면 로봇 팔을 사용하여 조직에 액체 자극을 가합니다.안녕하세요, 저는 Washington University School of Medicine의 해부학 및 신경생물학과의 Tim Wholly 연구실 소속 Hannah Arnon입니다. 저 또한 Wholly 연구실의 Cheyenne Fu입니다. 오늘은 V nasal organ의 다전극 어레이(multi electrode array) 기록 절차를 보여드리겠습니다.저희 연구실에서는 부비강 시스템의 감각 특성이나 수용체 뉴런을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 이제 시작하겠습니다. 전기 신호 기록은 질화규소로 절연된 10 µm 평면 질화티타늄 전극이 포함된 평면 다중 전극 어레이(MEA)를 사용하여 수행합니다.60개의 전극이 중심 간 간격이 30 $\mu\text{m}$인 5x6 그리드로 구성된 두 개의 필드에 배치되어 있습니다. MEA 10 60 증폭기를 사용하여 전기 신호를 증폭합니다. 10 $\text{kHz}$에서 1000배의 신호 증폭이 필요합니다.데이터 수집 카드와 맞춤형 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여, 조직을 나일론 메시로 MEA 위에 고정합니다. 이 메시는 배양 용기 내부에 딱 맞게 설계된 맞춤형 인서트에 부착되어 있습니다. MEA의 측정 과정을 살펴보았으므로, 이제 VNO 박리 방법을 알아보겠습니다. 박리를 수행하기 전, MEA 웰을 소 혈청 알부민(bovine serum albumin) 또는 BSA로 채운 다음, 따뜻한 기포 함유 링거액(bubbled ringer solution)을 사용하여 MEA를 헹구고 얼음 위에 놓으십시오.해부를 준비하기 위해, 60 by 15 밀리미터 페트리 접시 두 개에 기포 제거한 링거 용액을 채워 얼음 위에 둡니다. 또한, 동일한 크기의 실 가드(sill guard) 코팅 페트리 접시 두 개에 링거 용액을 채워 얼음 위에 둡니다. 해부 중에 사용할 기포 제거한 링거 용액 50 밀리미터를 추가로 냉각해 둡니다.희생된 마우스의 입 옆면에서 턱선을 따라 머리 뒤쪽까지 양측으로 절개하며 시작합니다. 목 뒤쪽

multielectrode-array-recordings-of-the-vomeronasal-epithelium

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

electroolfactogram (EOG) 녹음은 후각 상피의 수준에서 후각 기능을 평가의 유익 - 실시 - 쉽고 안정적​​인 방법입니다. 이 프로토콜은 녹음 설정, 마우스 조직 준비, 데이터 수집, 그리고 기본적인 데이터 분석을 설명합니다.

에어 - 상 Electroolfactogram 기록을 사용하여 마우스 강한 감각 뉴런의 분석 응답

대뇌 피질의 임계 상태 역학 지표의 연결 눈사태, 즉 스케일 - 불변량 spatio - 관자놀이 활동 파열을 연구하는 강력한 방법입니다. 눈사태 정확하게 제어 조건 하에서 평면 통합 다중 전극 어레이 (MEA)와 활동의 장기 측정을 허용 교양 피질의 표면 레이어를 개발에 자발적으로 등장.

Organotypic 문화에의 연결을 눈사태의 다중 전극 어레이 레코딩

서골비기관(VNO)은 사회적 및 생식 정보를 전달하는 종내 화학 신호를 감지합니다. 본 연구진은 VNO 조직에서 G-CaMP2를 발현하는 형질전환 생쥐를 사용하여 Ca2+ 이미징 실험을 수행하였습니다. 이러한 접근 방식을 통해 수많은 페로몬 자극에 대한 서골비 뉴런의 복잡한 반응 패턴을 분석할 수 있습니다.

영상의 연결 응답 Vomeronasal 조직의 슬라이스 준비에 유전적으로 인코딩된 칼슘 센서를 표현

이 비디오는 천공 패치 클램프 기술을 사용하여 마우스의 후각 감각 뉴런(OSN)을 전기생리학적으로 기록하는 방법을 보여줍니다. 형광단이 부착된 냄새 수용체를 가진 OSN을 포함하는 후각 상피는 마우스에서 분리되어 기록 챔버에 고정됩니다. 기록 피펫은 OSN의 수지상 손잡이에 고정되고 피펫 내의 니스타틴은 멤브레인에 구멍을 뚫어 세포와 전기적 연결을 형성합니다. 마지막으로, 다른 피펫을 사용하여 냄새 자극제를 전달하고 패치된 세포의 전기 생리학적 활성을 기록합니다.

생쥐의 후각 감각 뉴런에 대한 천공된 패치 클램프 기록

프로토콜 비디오는 마우스의 vomeronasal organ(VNO)의 감각 뉴런에서 전기생리학적 기록을 위한 전체 세포 패치 클램프를 설정하는 방법을 설명합니다. 형광 표지된 감각 뉴런이 있는 코로나 VNO 슬라이스가 기록 설정에 배치됩니다. 표지된 뉴런은 화학적 자극에 대한 반응으로 전기생리학적 기록을 위해 전체 세포 구성의 기록 피펫으로 패치됩니다.

Vomeronasal Sensory Neuron의 전기생리학적 기록을 위한 전체 세포 패치 클램프 구축

우리는 invertebrate 후각 경로의 처음 세 단계에서 냄새 evoked 응답을 특징하는 세포 다중 단위 기록 기술의 변화를 보여줍니다. 이 기술은 쉽게뿐만 아니라 다른 신경 시스템에서 앙상블 활동을 검토하도록 구성 할 수 있습니다.

메뚜기에 신경 활동을 특성화하기 위해 다중 단위 기록 방법 (<em&gt; Schistocerca 아메리카나</em&gt;) 강한 회로

두 개의 서로 다른 뇌 neuropiles 또는 두 개의 서로 다른 해부학 책자에서 동시 세포 장기 기록은 꿀벌에 설립되었다. 이 기록은 다른 뇌 영역 하나의 신경 세포에서뿐만 아니라 행동 동물의 앙상블 수준에서 신경 세포의 처리 시간 측면의 조사를 할 수 있습니다.

행동을 한 꿀벌 두 신경 처리 단계에서 동시 장기 녹음

마우스 액세서리 후각 전구 (AOB)는 감각 코딩의 맥락에서 공부하기 어렵다. 여기, 우리는 AOB 신경 마우스 페로몬과 kairomones의 정보 처리에 대한 연구를 촉진, 자신의 주변 입력에 기능적으로 연결되어있는 한 생체 준비를 생산하는 절개를 보여줍니다.

본래 Vomeronasal 기관 및 액세서리 후각 망울의 생체 준비

우리는 여기서 인간의 간질 대뇌 피질 조직의 다중 전극 배열 녹음을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 간기 및 발작 사건의 간질 조직 절제술, 슬라이스 준비 및 다중 전극 배열 기록은 구체적으로 입증된다.

인간의 간질 수술 후 두피 조직의 다중 전극 어레이 레코딩

후각 감각 뉴런의 생리학적 특성을 분석하는 것은 여전히 기술적 한계에 직면해 있습니다. 여기에서 우리는 유전자 표적 마우스의 후각 상피의 온전한 준비에서 천공된 패치 클램프를 통해 기록합니다. 이 기술을 사용하면 정의된 후각 수용체를 발현하는 뉴런의 특정 리간드에 대한 멤브레인 특성과 반응을 특성화할 수 있습니다.

본래 Neuroepithelium에서 마우스 강한 감각 뉴런의 천공 패치 클램프 녹음 : 확인 된 부 취제 수용체를 발현 뉴런의 기능 분석

여기에서는 전체 세포 패치-클램프 기록을 사용하여 마우스 조개 기관의 급성 관상 조직 절편에서 정의된 감각 뉴런 집단을 식별하고 심층 분석할 수 있는 생리학적 접근 방식을 설명합니다.

마우스 보습 코 기관의 급성 조직 조각에서 정의 된 세포 집단의 심층 생리 학적 분석

학습하세요 생쥐 VNO에서 다중전극 배열을 이용한 전기생리학 기록 방법을. 로봇 암을 활용한 정밀 자극으로 후각 신경 처리 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

Vomeronasal 상피의 Multielectrode 배열 레코딩

더 많은 동영상 탐색