Hi-C: Un método para estudiar la arquitectura tridimensional de los genomas.

Hi.C es un método para identificar interacciones de cromatina a largo alcance de manera imparcial en todo el genoma. Primero, las células se fijan con las células de formaldehído se lisan y el ADN se fragmenta posteriormente con una enzima de restricción. A continuación, se incorpora un residuo biotinilado al rellenar los cinco salientes principales en romo y la ligadura se realiza en condiciones diluidas que favorecen los eventos de ligadura entre enlaces cruzados y fragmentos de ADN.

La biblioteca está cortada y las uniones se derriban con cuentas de Havein de estreptococo. Las uniones purificadas pueden analizarse posteriormente usando un secuenciador de alto rendimiento, lo que resulta en un catálogo de fragmentos interactuantes. Estos resultados nos proporcionan información sobre el plegamiento de la cromatina, revelando la presencia de territorios cromosómicos, la compartimentación com del genoma en la cromatina ch abierta y cerrada y evidencias de la organización Fractal Glo a escala Megabase.

Hola, soy Nka Van Bergham del Laboratorio Field Decker en el programa de función y expresión génica de la Facultad de Medicina de la Universidad de Massachusetts. Hola, soy Ez Lieberman Aiden del laboratorio de Eric Lander en el Broad Institute de Harvard y el Instituto Tecnológico de Massachusetts. Soy Louis Williams, del grupo de investigación y desarrollo de biología molecular en el Broad Institute, y luego Maxima Mackay, del laboratorio de Len Muni, del Instituto Tecnológico de Massachusetts.

Hoy te mostraremos un procedimiento para la captura de confirmación cromosómica a nivel genómico llamado alta C. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para explorar experimentalmente la arquitectura del genoma humano. La primera parte del procedimiento que te mostraremos tendrá lugar en la Facultad de Medicina de UMass y la segunda parte se realizará en el Instituto Prude. También te mostraremos cómo hemos utilizado los resultados del experimento de alta C para simular la dinámica del genoma en el MIT.

Así que empecemos. Así que, vamos a empezar. La Hi C comienza con la reticulación de células, que es un método común en la captura de confirmación cromosómica.

Para comenzar a crecer entre dos veces 10 a siete y 2,5 veces 10 a siete células de mamíferos, ya sea en suspensión o en suspensión y entrecruzamiento de las células, se encuentran las células en 550 microlitros de tampón de lisis usando homogeneizador. Centrifuga la cromatina a 5.000 RPM y lava el pellet dos veces con 500 microlitros de buffer NEB dos qu en cinco tubos numerados y añade cualquier buffer B. Dos por un volumen final de 362 microlitros.

Añade 38 microlitros de mezcla al 1% de SDS, con cuidado y incuba a 65 grados Celsius durante 10 minutos. Colocar los tubos de nuevo sobre hielo inmediatamente y apagar la SDS añadiendo 44 microlitros de Triton X 100 mezclados cuidadosamente a 400 unidades de Hindi 3 e incubar a 37 grados Celsius durante la noche mientras se rota. Los siguientes pasos son específicos de alta C e incluyen marcar los extremos del ADN con biotina y realizar la ligadura roma de fragmentos reticulados.

Este paso permitirá purificar posteriormente las uniones de ligazón. No se debe pasar por el paso de etalación por biotina y en su lugar debe servir como un control de tres C para asegurar que las condiciones de digestión y ligación sean óptimas para rellenar los voladizos de fragmentos de restricción y marcar los extremos del ADN con biotina en los cuatro tubos restantes. Añadir D-A-T-P-D-G-T-P y DTTP a los tubos dos a cinco.

También añade biotina elated DCTP y Klino. Mezcla con cuidado y incuba durante 45 minutos a 37 grados Celsius. Tras la incubación, coloca los tubos sobre hielo y luego añade 86 microlitros de SDS al 10% a todos los tubos para inactivar las enzimas.

Incuba los tubos a 65 grados Celsius durante exactamente 30 minutos y colócalos en hielo inmediatamente después. Para favorecer eventos de ligadura entre fragmentos reticulados, la ligadura se realiza en condiciones extremadamente diluidas. Trabajando sobre hielo, añade 7,61 mililitros de mezcla de ligadura a cada uno de los cinco tubos de 15 mililitros.

Luego transfiere cada mezcla de cromatina digerida al tubo correspondiente. Añadir 10 microlitros de ligasa de ADN T 4 al tubo uno para realizar una ligadura C regular de tres cilindros. Luego se añaden 50 microlitros de ligasa de ADN T 4 a los tubos dos a cinco para realizar la ligadura roma en C alto.

Mezcla los tubos invirtiéndolos y incuba durante cuatro horas a 16 grados Celsius. Tras la incubación, la proteína se degrada e invierte la reticulación cruzada de la CNA añadiendo 50 microlitros de proteinasa K por tubo e incubando los tubos durante la noche a 65 grados Celsius. Añade 50 microlitros adicionales de proteinasa K por tubo al día siguiente y continúa incubando a 65 grados Celsius durante otras dos horas.

Llama a las mezclas de reacción y transfierelas a cinco tubos cónicos de 50 mililitros. Purifica el ADN de estos tubos realizando una extracción de fenol. Añade 10 mililitros de fenol y vórtice durante dos minutos.

Gira los tubos durante 10 minutos a 3.500 RPM y transfiere cuidadosamente la mayor parte posible de la fase acuosa a un tubo nuevo de 50 mililitros. Se repite la extracción usando fenol cloroformo y se precipita el ADN con etanol tras la centrifugación del ADN precipitado por etanol; cada pellet de ADN se disuelve en 450 microlitros de un tampón XTE y se transfiere a un tubo centrífuga de 1,7 mililitros. Otra ronda de purificación se realiza mediante dos extracciones de fenol cloroformo a 500 microlitros de fenol, cloroformo y vórtice durante una centrifugadora de un minuto a los tubos durante cinco minutos a 14.000 RPM, y transfiere la fase acuosa a un nuevo tubo tras la segunda extracción.

El ADN es etanol precipitado tras centrifugar el ADN precipitado; cada pastilla de ADN se lava una vez con etanol al 70% y luego se resuspende en 25 microlitros de un tampón XT, degradando cualquier ARN presente añadiendo un microlitro de ARN por tubo e incubando los tubos durante 30 minutos. A 37 grados Celsius. Extrae el contenido alto de C de los tubos dos a cinco, manteniendo el tubo uno separado como un control de tres C.

Ahora es un buen momento para examinar la cantidad y calidad de las bibliotecas analizando una alicuota en un gel AASE al 0,8% que marque la eficiencia de ligadura de HI C que debe evaluarse con un ensayo de digestión por PCR. La creación y ligadura de los extremos romos realizadas en el procedimiento HI C crearán sitios de restricción para la endonucleasa en HE uno; los fragmentos amplificados de las tres bibliotecas C y C alta pueden digerirse con Hindi tres y NHE uno para determinar qué tan bien se generaron los extremos romos y algunos fragmentos no habrán sido ligados. Eliminar la biotina de estos extremos no ligados utilizando la actividad de la nucleasa exón de la ADN polimerasa T 4 tal como se describe en el protocolo escrito.

Purificar el ADN de nuevo mediante extracción de fenol cloroformo y precipitación de etanol, y volver a suspender los pellets de ADN en un volumen total de 100 microlitros de agua. Si la muestra ha pasado los ensayos de control de calidad, el protocolo continúa con el bio timple y la secuenciación. Gracias.

Para que el ADN BIOTINILADO sea adecuado para la secuenciación de alto rendimiento, el ADN debe compartirse en un tamaño de 300 a 500 pares de bases con un instrumento CAVAS S dos. Las DNS se reparan añadiendo 10 x tampón de lación, DN TPS T cuatro ADN polimerasa, T cuatro POLINUCLEÓTIDOS quinasa transparente, ahora la ADN polimerasa y el agua incuban las muestras durante 30 minutos a temperatura ambiente tras la incubación, utilizando una columna Kaya Gym MinLu para purificar el ADN según las recomendaciones del fabricante. Después de cargar el ADN en la columna y lavarla, eluir el ADN con 50 microlitros de un buffer XTLE dos veces, luego unir DATP a los tres promenes del ADN reparado añadiendo 10 buffers XNEB, dos fragmentos de CILE deficientes en exonucleasas.

Incubar la reacción durante 30 minutos a 37 grados Celsius para inactivar el fragmento de cile. Incubar las reacciones durante 20 minutos a 65 grados Celsius y posteriormente llamar a las reacciones sobre hielo usando un aspirador rápido, reduciendo los volúmenes de reacción a 20 microlitros. Después, carga el ADN en un gel de Aris al 1,5% con un XTAE y haz funcionar durante 3,5 horas a 80-90.

Los Vols extirpan fragmentos de ADN entre 300 y 500 pares de bases y los purifican con un kit de extracción de gel Qiagen usando dos a cuatro columnas, dependiendo del peso del gel. Combina los ocho amarillos de las columnas rápidas del kayak y sube el volumen final a 300 microlitros con un buffer XTLE. Finalmente, determina la concentración de ADN con el ensayo QU usando el qubit y calcula la cantidad total de ADN en esta sección del protocolo.

Las uniones de ligación se purifican del depósito de ADN, lo que permite una identificación eficiente de fragmentos de cromatina interactuantes mediante la secuenciación de extremos emparejados. Realiza todos los pasos posteriores en tubos de baja unión con ADN. Prepara cuentas para la biotina.

Tira hacia abajo lavando 150 microlitros de estreptococo magnético A resuspendido en perlas dos veces con 400 microlitros de un tampón x tween. Estos en lavados futuros consisten en cinco pasos: añadir tampón a las perlas, transferir la mezcla a un nuevo tubo y girar la muestra durante tres minutos a temperatura ambiente. Recuperando las cuentas usando un concentrador de partículas magnéticas.

Estoy quitando el supinado reus. Dobla las perlas en 300 microlitros de dos tampones no tween y combínalos con 300 microlitros de CDNA alto. Permite que la biotina marcada como alto CDNA se una a las perlas de estreptococo incubando la mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos con rotación.

Recupera la estrécdota A unida al ADN en perlas con un concentrador de partículas magnéticas y elimina el sobrenadante. Lava las perlas con 400 microlitros de un tampón x no tween, seguido de 100 microlitros de una ligadura x. Amortiguador. Resuspende las perlas en 50 microlitros de un buffer de ligadura x y transfiere la mezcla a un tubo nuevo.

Para preparar el ADN para Illumina emparejado en la secuenciación, toma la cantidad total de entrada de ADN del usuario para la extracción de biotina hacia abajo, que se calculó anteriormente usando el ensayo cuantitativo, y divídela entre 20 para estimar la cantidad de CDNA alto que se ha bajado y está disponible para ligación. Añadir seis OLS P de Illumina emparejados y adaptadores por microgramo de alto CDNA disponibles para ligadura. Utiliza 1.200 unidades de ligasa de ADN T4 para ligar los adaptadores al ADN.

Incuba las dos horas a temperatura ambiente. Quita los adaptadores de extremo emparejados no ligados recuperando las perlas con alta ligazón a CDNA y lavando las perlas dos veces con 400 microlitros de un buffer x tween. Lava las esferas con 200 microlitros de un x, sin tween buffer, seguido de 200 microlitros y luego 50 microlitros de un buffer XNEB.

Dos después del último lavado. Resuspende las perlas en 50 microlitros de un buffer NEB dos y transfiere a un tubo nuevo. Determinar el número de ciclos necesarios para generar suficiente producto PCR para la secuenciación.

Establece cuatro pruebas de reacción PCR con 6, 9, 12 o 15 ciclos. Determinar el número óptimo de ciclo ejecutando las reacciones de PCR sobre un gel de poliacrilamida de 5 centavos y teñiendo con verde cibernético, asegurando la ausencia de bandas espurias y la presencia de una mancha entre 400 pares de 600 bases, que es la longitud de los productos compartidos tras la ligación con los adaptadores, amplificando el resto del cartucho de alta C de la biblioteca despojado, tienen en perlas en una PCR a gran escala con el número óptimo de ciclos de PCR. Saca los productos de PCR de los pozos separados y recupera las cuentas.

Mantén separado el 1% de los productos de PCR a gran escala para que funcionen en un gel y purifica el resto del producto con 1,8 veces el volumen y perlas puras según las recomendaciones del fabricante. Eluye el ADN con 50 microlitros de un buffer XTLE y compara el 1% del producto de PCR purificado con perlas de PU con el 1% de la PCR original en un gel de acrilamida al 5%. Para asegurar la eliminación exitosa de la secuencia de cebadores PCR, la biblioteca de alta C con secuenciación de extremos emparejados Illumina alinea cada extremo de forma independiente usando MAC para identificar fragmentos de cromatina interactuantes.

Se esperan los siguientes resultados cuando el protocolo de alta C se ejecuta técnicamente bien y pueden considerarse estándares de control de calidad. Los pasos de control de calidad deberían revelar que tanto las bibliotecas C como las de C alto funcionan en bandas bastante ajustadas y mayores que 10 kilos de base. Una citología de ADN indica una mala eficiencia en la ligazón.

Normalmente, la eficiencia de ligación es ligeramente menor en una biblioteca de alta C en comparación con una plantilla de tres C. La alta eficiencia de marcado C y la ligadura pueden estimarse mediante la digestión de un producto de tres CPCR. Tres cruces C son cortados por Hindi Three y no por NHE uno.

Lo contrario ocurre con las uniones en C alto. Este ensayo de digestión PCR muestra que el 70% de los amplicones de alto C son eliminados por NHE uno y no por HI hindi. Tres. Confirmando la eficacia de marcado de las uniones de ligadura, el análisis de las lecturas secuenciadas debería mostrar que las lecturas tanto de las interacciones intracromosómicas como intercromosómicas indicadas por las líneas azul y roja se alinean significativamente más cerca de los tres sitios de restricción en hindi en comparación con las lecturas generadas aleatoriamente mostradas en verde.

En un experimento exitoso, el 55% de los pares de lectura alineables representan interacciones entre cromosómicas. El 15% representa interacciones intracromosómicas entre fragmentos separados por menos de 20 kilobases, y el 30% son pares de lectura intracromosómica separados por más de 20 kilobases. Esta distribución puede muestrearse antes de la secuenciación de alto rendimiento como forma de control de calidad.

La clonación y la secuenciación de Sanger alrededor de 100 clones suelen ser suficientes. Las interacciones de la cromatina pueden visualizarse como un mapa de calor donde los ejes x y Y representan el orden genómico de signos bajos y cada píxel representa el número de interacciones observadas entre ellos. Normalmente, los fragmentos de ADN muy cercanos entre sí en el genoma lineal tienden a interactuar frecuentemente entre sí.

Esto se observa en los mapas intracromosomicos o de calor como una diagonal prominente. Los siguientes resultados muestran diferentes formas de analizar los datos para revelar distintos niveles de genoma. La organización que grafica la probabilidad de contacto frente a la distancia genómica muestra que la probabilidad de contacto disminuye en función de la distancia genómica alcanzando finalmente una meseta en cada distancia.

Las interacciones intracromosómicas mostradas en la línea sólida están enriquecidas en relación con las interconexiones cromosómicas entre interch representadas por las líneas de guion. Esto implica directamente que la presencia de territorios cromosómicos calcula el número observado frente al esperado de contexto intercromosómico entre todos los pares de cromosomas revela una asociación preferencial entre pares cromosómicos particulares. Los cromosomas pequeños ricos en genes interactúan preferentemente entre sí, indicado por el color rojo brillante.

También se pueden examinar cromosomas individuales. El mapa de calor en bruto puede ajustarse usando un mapa de calor esperado para tener en cuenta la distancia genómica entre pares de loci, resultando en un mapa de calor observado sobre el esperado. Entonces se puede producir una matriz de correlación correlacionando las filas y columnas de los mapas de calor observados sobre esperados.

Mediante análisis de correlación, ha demostrado que el genoma humano se segrega en dos compartimentos. Esto se ilustra con el patrón de cuadros. En los mapas de calor de correlación utilizando datos de alto nivel de carbono, se obtuvieron nuevos conocimientos sobre el plegamiento de la cromatina a escala de megabases.

Un modelo polimérico ordinario de empaquetado de cromatina sugeriría que el empaquetamiento de cromatina en un GLO de equilibrio grafica la probabilidad de contacto es función de la distancia ilustra que la probabilidad de contacto escala como una ley de potencia con distancia genómica cuya pendiente es aproximadamente menos uno. Esto no es consistente con el comportamiento de un Glo de equilibrio, pero sí coincide con las expectativas de una estructura alternativa conocida como glo fractal. Aquí se muestran dos estructuras gulares.

La coloración corresponde a la distancia desde un extremo que va desde azul hasta verde cian, amarillo, naranja y rojo. Y al igual que los glóbulos de equilibrio, los glóbulos fractales carecen de entrelazamientos en un glo fractal. Los loci cercanos a lo largo del contorno tienden a estar cerca en 3D, lo que conduce a la presencia de bloques monocromáticos.

Tales bloques no se encuentran en el Glo de equilibrio. La ausencia de entrelazamientos también puede demostrarse eliminando la fuerza que restringe a los glóbulos y permitiendo que se expandan; el glo fractal se condensa rápidamente. Mientras que el Glo de equilibrio no lo hace porque está demasiado enredado.

Acabamos de mostrarte cómo hacer que un analizador sea una biblioteca de alta C. Al realizar este procedimiento, es importante recordar los controles adecuados para asegurar una ligadura y purificación eficiente en alta C. El número de lecturas determinará finalmente la resolución de los mapas de interacción.

Hemos utilizado unas 30 millones de lecturas para generar mapas de interacción del genoma humano con una resolución de aproximadamente una megabase. Para aumentar la resolución por un factor de N, el número de lecturas debe incrementarse por un factor de n al cuadrado. Espero que disfrutes aprendiendo sobre la estructura del genoma humano.

Así que eso es todo. Gracias por vernos y mucha suerte con tus experimentos.