La disección del Organizador y explantes Animal Polo de Xenopus laevis embriones y de la Asamblea de un ensayo de adhesión celular

Hola, mi nombre es Sochi Agata. Soy científico postdoctoral en el laboratorio del Dr. Ken Cho en desarrollo de biología celular y del desarrollo en la Universidad de California Irvine. Hoy voy a mostrar el ensayo de disección y adhesión de la tapa del animal explan u organizador expandido a partir del embrión de rana XUS.

Este procedimiento se puede utilizar para estudiar las características de adhesión celular y la morfología celular de la célula derivada del tejido disecado. Este procedimiento consiste en la disección de un determinado tejido del embrión de rana xenopus y se disocian en un medio libre de calcio y magnesio y luego llevan esa célula disociada a la condición contenedora que contiene calcio y magnesio en la parte superior de la adhesión celular, vidrio deslizante recubierto de molécula. Y podemos estudiar el comportamiento celular, la migración celular y las características de adhesión de la X diseccionada en este procedimiento.

Está bien, todo este procedimiento de disección del embrión y ensayo de adhesión, primero utilizo herramientas especiales extranjeras. Se trata de una barra x libre de calcio y magnesio, 1% agro rociado. Y esto es justo aquí, una barra x, 1%agro rociada en la que se disecciona el embrión.

Y luego esta es una herramienta de disección, una herramienta especial de disección que no son los fórceps. Esto se llama cuchillo para cejas, que es un nombre extraño, pero en realidad está hecho literalmente de tu ceja que se separa de tu cara. Y luego pegar en la punta de la pipeta de pasta.

Y esta la otra herramienta aquí se llama bucle para el cabello, que es nuevamente su cabello haciendo un bucle en la punta de la pipeta pasada. No usé esta herramienta esta vez en particular, pero algunas personas prefieren este lazo para el cabello más que el cuchillo de globo ocular y, por lo tanto, el ensayo de adherencia. Utilizo el aislante de caucho de silicona en el que se pega en la parte superior del vidrio deslizante para hacer que la cámara de ensayo de adhesión reaccione a la adhesión.

Así que primero saca la envoltura de vid del embrión. Esta pieza es envoltura de vid. A continuación, disecciona el áder de poste animal.

Esto es un proyecto animal, no lo necesitas. Dale la vuelta al embrión y verás ese labio dorsal claro aquí. Es hermoso.

Luego tome el cuchillo del globo ocular, péguelo al lado del labio dorsal, pegue también el otro lado y luego corte esta pieza justo debajo del labio dorsal. Y esta pieza contiene organizar el yo y la dermis circundante. Le das la vuelta a esto y despegas la parte abdominal del organizador interno.

Está bien, destruyo la parte dérmica, pero eso no es importante. Así que no pasa nada. Y esta pieza de la derecha es la medida del organizador.

Acabo de pasar al lado más limpio del plato. La pieza de la derecha es la pieza organizadora mera y esta es el embrión entero. Y ahora ves el cómo, cómo, cómo, cuánto es el tamaño de la pieza organizadora.

Y esto se puede utilizar como un extractor de algún factor que exprese la región organizadora o hacer un CD organizador en la biblioteca o estudiar la termología en el tejido romal migratorio. Antes de diseccionar la gorra de los animales, debe encontrar la etapa correcta. Utilizamos embrión blasto en etapa ocho.

Y ahora aquí vemos en la vista a tres el embrión en tres etapas diferentes. El embrión dos en el lado izquierdo es la etapa siete blast y el embrión M dos en el medio es la etapa ocho. Y el lado derecho dos embriones son la etapa casi etapa nueve blaster tardío.

Y nos gusta ver, nos gusta usar la etapa ocho en el medio también porque se ve, en primer lugar, se ve la clara diferencia de cada yegua explosiva en el poste animal. Y este embrión de la etapa ocho le brinda la buena combinación de sitios celulares agradables y fácil de diseccionar en la etapa siete. El polo animal que la célula es demasiado grande y el número es demasiado pequeño, mientras que el embrión de la etapa nueve cada célula es demasiado pequeño y también el tejido del pro exoma animal se vuelve más delgado que la etapa ocho.

Para que no obtengas tantas celdas como quieras. Primero se pega la pinza al costado del embrión y se saca la envoltura de la vid del embrión. Esta es la envoltura de la vid.

Y luego se disecciona el centro del polo animal del embrión. Está bien, esta es una pieza hermosa. A la izquierda se muestra el sombrero del animal disecado y este es el resto del embrión.

Y esta pieza puede ser, el uso de esta pieza es, por ejemplo, si inyectas algo en el polo animal del embrión en la etapa más temprana como la construcción del gen de Oporto, luego diseccionas esta pieza en la etapa posterior y la usas para el ensayo de Oporto como el ensayo recíproco, por ejemplo. Ahora voy a utilizar el trasplante y la transferencia del organizador x explan para estudiar el ensayo de adhesión celular. Y para hacer eso necesito disociar disociar el organizador X explan en el mecanismo de calcio tres medio.

Así que estoy transfiriendo de transferir el organizador explan de este plato de nacimiento regular a un plato mediano sin calcio y magnesio. Pero para hacer eso, si eres muy bueno con tu mano, puedes usar esta pipeta de transferencia regular, pero tienes alguna posibilidad remota de dañar el embrión mientras lo haces. Así que yo, lo que suelo hacer es usar P 200 y punta amarilla.

Y esta punta amarilla está previamente codificada con este código químico de código único para evitar que la célula se pegue al lado de la punta amarilla. Y también corté la punta con unas tijeras en la punta de la punta amarilla para que la punta ahora esté desafilada y de gran diámetro para minimizar la posibilidad de dañar DX explan. Bien, ahora lo que ves en la vista es el menú de dos organizadores y yo, voy a transferir estas dos piezas de este plato regular exprés a un plato mediano sin mecanismo de calcio.

Succiona lentamente esos pedazos y transfiéralos al medio libre de calcio y magnesio. Y ahora cómo, así es como se ven al principio y ahora estamos disociados casi a nivel de una sola célula. Ahora los explan organizados están en medio libre de calcio y magnesio y los incubaré en medio libre de mecanismo de calcio durante una hora para permitir que se disocien al nivel de una sola célula para el siguiente paso de estudiar la morfología o el comportamiento de la célula después de una hora de incubación de la célula, me refiero al explan organizado que se supone que está disociado.

Están bastante bien. Y ahora echa un vistazo a los micros y al microscopio. Lo son, sí, se ven bastante Acción.

Bien, ahora estoy estudiando el comportamiento de la célula en la cámara de imágenes de portaobjetos que la atrapó con cadherina o INE u otro tipo de molécula de adhesión celular para hacer una cámara de imágenes de adhesión celular. Tomo esta diapositiva y también este aislante de caucho de silicona y simplemente coloco el aislante de caucho de silicona en la superficie del portaobjetos y presiono firmemente para asegurarme de que se adhieran alrededor de este círculo. Y luego mira desde el otro lado para asegurarte de que se pegue completamente para que el líquido no se escape por encima.

Sobre esta cámara de arena vierto la gota de 200 microlitros de cell dehe, la suspensión que contiene proteínas de adhesión celular como la cohesión o la fibronectina. Y después de eso bloquear esta cámara con 500 microlitros de 4%BSA. Y luego reemplazamos A BSA con un bus x normal, un medio fian.

Y ahora parece que aquí hay una cámara lista para transportar la célula. Así que esta cámara, tomo esto de nuevo, este un P 200 unido con una punta amarilla cortada recubierta con código sigma y aspiro la célula desde el medio libre de calcio y magnesio a esta cámara, que contiene el medio, que también contiene el calcio y el magnesio. Ahora, está bien, ahora estoy transfiriendo este punto X del organizador disociado usando P 200.

Primero se pega este P 200 y se succiona lentamente la célula y se puede subir y bajar muy suavemente. Aún así, estoy esparciendo la célula por todas partes, pero para asegurarme de que sean de una sola célula, entonces coloque esta cámara de imágenes en el centro de su vista, luego extienda la célula por todas partes en la cámara de imágenes. Ahora las células se extienden sobre la superficie recubierta recubierta.

Y veamos, en la tubería superior las celdas se ven así. Bien, después de dos tres horas extendiendo la célula en la cámara adhesiva, cuento la célula en esta cámara con este microscopio. Por lo general, cuando se trata de estudiar la adhesión de la célula del órgano del explante organizador, se deja la célula encima del portaobjetos recubierto durante dos o tres horas.

Y luego, después de eso, puede cuantificar el número de células en el portaobjetos bajo el microscopio para lavar. Lave la celda DO tres adjunta o intacta, simplemente coloque esta capa en la cámara de hesión en el cubo de tampón, que contiene una gran cantidad de tampón. Y luego comience la agitación a una velocidad muy suave, como 50 RPM, que es aproximadamente la velocidad, y espere cinco minutos.

Después de cinco minutos, retire con cuidado esta cámara de adhesión sin exponer la celda dentro de esta cámara de adhesión. Por lo tanto, se retira con cuidado de esta manera, luego se limpia el exceso de tampón y se estudia bajo el microscopio nuevamente para contar cuántos por ciento de las células permanecen unidas a la superficie recubierta. Ahora, después del lavado, vuelva a colocar esta cámara de adhesión en el mismo lugar para asegurarme de que estoy observando la misma ubicación exacta de la cámara de adhesión.

Y ahora empieza a contar. Entonces, en esta pantalla se muestran dos tipos diferentes de células en el tercer tipo de molécula de adhesión celular. Y esos dos tipos de celdas muestran características de adhesión completamente diferentes en el mismo profesional.

En la parte superior de la misma célula adhesiva proteína adhesiva. También podríamos usar esta celda dis asociada del explan para su comportamiento de agregación o migración en imágenes de lapso de tiempo.