DNA修復タンパク質の作用のメカニズムを調べるためにストップトフロー速度論の手法の適用

これは、マッシュの反応速度を測定するための2つの停止フロー方法のプレゼンテーションです:マッシュ2マッシュ6 DNAミスマッチ修復タンパク質マッシュ。Two mush sixは、TPによって供給される反応でDNAとシグナルの修復の塩基対のミスマッチを認識します。第1の方法は、DNA中のGT MISペアに隣接して配置された2アミノプリン塩基の蛍光の増加によって、DNAに結合するマッシュ2マッシュ6を測定します。反応物は停止したフロー装置で混合され、経時的に監視されて速度Constanceが決定されます。

第2の方法は、蛍光リン酸結合タンパク質レポーターを使用して、マッシュ2マッシュ6 a TPA活性を測定する。反応物は停止した流れで混合され、時間の経過とともに監視されます。TP加水分解とリン酸放出の速度定数を決定するために、得られた速度論的データにより、DNAミスマッチ修復におけるマッシュ2マッシュシックの作用機序が解明されます。

こんにちは、ウェズリアン大学の分子生物学および生化学部門のMONI研究室のNoah Biroです。こんにちは、同じくウェズリアン大学のMan's LaboratoryのDJ Jです。そして、同じくJI'S LaboratoryのChris Dsetです。

本日は、ミリ秒のタイムスケールで反応の動態をモニターするための2つの蛍光ベースのアッセイをご紹介します。私たちの研究室では、この方法を使用して、DA修復タンパク質がDNAの塩基対に一致しない2つ、meh sixが結合し、修復を開始する方法を研究しています。それでは始めましょう。

この手順を開始する前に、必要なタンパク質およびDNA試薬がすぐに利用できる必要があります。以前に大腸菌で過剰発現し、イオン交換およびアフィニティークロマトグラフィーによって精製された2つのマッシュ6タンパク質を取得します。DNA試薬を生成するには、アミノプリンに蛍光ヌクレオチド類似体で修飾された一本鎖DNAを購入し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって鎖を精製し、それらをeleしてGTミスマッチに隣接する2つのアミノプリンとミスマッチな二本鎖DNAを生成します。

同様に、未修飾の一本鎖DNAから非標識DNAを調製します。ここで使用されるDNA配列は、このプロトコルの書かれた部分に記載されています。この手順全体を通じて、蛍光不純物を最小限に抑えるために高品質の薬品を使用し、高い実験の完全性を確保します。

また、0.2マイクロメートルのメンブレンですべてのストック溶液をろ過し、停止したフロー装置を詰まらせる可能性のある微粒子を除去します。DNA結合実験の準備として、サンプルあたり400マイクロリットルの最終容量のサンプルを準備します。これは、約10のキネティックトレースに十分な量です。サンプルを氷の上に保ちます。

タンパク質活性を維持するために、DNA結合バッファー中にDNAサンプルを0.12マイクロモルで調製し、マッシュ2マッシュ6サンプルを0.8マイクロモル濃度で調製します。これにより、最終濃度は0.06マイクロモルDNAと0.4マイクロモルマッシュになります。停止した流れで1対1で混合した後、2つのM6。

停止フロー装置は、駆動モーターを使用して、駆動シリンジからの反応液を同時かつ迅速に混合装置に押し込みます。その後、混合溶液は観察セルに流れ込み、データ収集のために機器を準備します。まず、コンピューターとコントローラーの電源がオフになっていることを確認します。

次に、循環水浴をオンにしてランプを冷却し、ランプに点火します。モノクロノメーターを目的の励起波長(315ナノメートル)に設定します。アミノプリン体が2個ある場合は、SL幅を希望の値に設定してください。

光電子増倍管またはPMTに350ナノメートルのカットオフフィルターを挿入して、2つのアミノプリン蛍光シグナルを収集します。コントローラーとコンピューターの電源を入れます。次に、循環水浴をオンにします。

これにより、ドライブシリンジの周りのウォータージャケットが満たされ、実験中に目的の温度のリアクタンスが維持されます。最後に、P-M-T-H-V制御のメニューの下にあるストップフロープログラムを実行します。PMT電圧を設定します。これは最初はPMT感度を調整するために可変にすることができますが、一定に保つ必要があります。

実験中に、暗電流を測定して、バックグラウンドの電気ノイズを補正します。次に、停止したフロードライブシリンジと観察セルを洗浄します。サンプルローディングバルブをロード位置にセットします。

1ミリリットルのシリンジに脱イオンろ過水を入れます。シリンジをドライブシリンジの下にあるローディングポートに取り付け、2つのシリンジの間に水を押し込みます。このプロセスをそれぞれ 2 回繰り返します。

実験で使用するドライブシリンジ。次に、ドライブシリンジに水を入れて観察セルを洗浄します。Sを切り替えますampファイルローディングバルブを発射位置にします。

[シリンジ駆動の調整] コマンドを使用して、駆動プレートを下げ、観察セルから出口ラインに水を押し込みます。プランジャーをドライブシリンジの最後まで押し込まないように注意してください。最後に、ドライブプレートを上げて、バルブを負荷位置に切り替えます。

反応バッファーで一度洗浄し、シリンジを空にします。DNA結合実験を開始するには、各サンプルをチューブから新しい1ミリリットルのシリンジに移します。各シリンジをローディングポートに取り付け、溶液をドライブシリンジに押し込みます。

断続的に一時停止して、2つのシリンジ間で溶液を手動で押して、気泡を取り除きます。.次に、ドライブプレートをドライブシリンジの上部に接触するまで下げます。データ収集の場合は、設定された時間チャネル ウィンドウを開きます。

データ分析のデータ収集チャネル・モードと、収集するトレースの数を選択します。1000 個のデータ ポイントが収集されるデータ収集時間を入力します。次に、バルブを火の位置に設定し、データの収集ボタンをクリックします。

この作用により、マッシュ2、マッシュ6、DNAの混合が開始され、続いて反応が観察結果に入力されます。2つのアミノプリンからの細胞蛍光発光をモニターします。少なくとも 5 つの運動学的トレースを収集して高品質のデータセットを取得し、実験が完了したらファイルを保存します。

各データファイルを開き、複数のキネティックトレースを平均化します。次に、平均データファイルを保存し、分析のためにグラフプログラムにエクスポートします。最後に、ランプを消し、シリンジと観察セルを水で広範囲に洗浄します。

次に、循環水浴以外の残りの機器の電源を切ります。これは、ランプを冷却するためにさらに15分間点灯したままにします。不一致のDNAに結合するマッシュ2マッシュ6の動力学的データは、単一の指数関数によって最適に適合され、これにより、モル1秒あたり10〜7分の1のオーダーで高速な会合が得られます類似の停止フロー実験は、毎秒0.01〜0.02で非常にゆっくりと発生するマッシュ2マッシュ6の不一致DNA複合体の解離速度をもたらします。

これらの結果は、2つのマッシュの速度と親和性を直接測定するものです。シックスは、DNA修復反応中に不整合な塩基対に結合します。次に、停止した流れの実験を行い、マッシュ2マッシュ6のA TPAs活性を測定する。

このアッセイの事前試験状態条件下では、バックグラウンドのリン酸塩レベルを最小限に抑えるために、タンパク質やDNAの精製を含む試薬調製のすべての段階でガラスの使用を避けることが絶対に必要です。大腸菌から精製され、MDCC蛍光色素で標識されたリン酸塩結合タンパク質またはPBPは、TP加水分解後のリン酸塩放出を測定するためのレポーターとして使用されます。M-D-C-C-C-P-B-Pは、研究前の状態A TP加水分解およびリン酸塩放出速度の堅牢なレポーターです。プレリン酸塩に迅速かつ高い親和性で結合するため、MDCC蛍光が大幅に増加します。

4マイクロモルのマッシュ、2つのマッシュ6タンパク質、6マイクロモルの不一致DNAの有無にかかわらずサンプルを調製します。溶解したばかりの 1 ミリモルの HEP と 20 マイクロモルの M-D-C-C-P-V-P で別のサンプルを調製し、汚染されたリン酸塩を拭き取ります。プリン、ヌクレオシド、ホスホリラーゼ、および7つのメチルギネをサンプルに加え、氷上で少なくとも20分間インキュベートします。

停止したフロー機器を前述のように準備します。さらに、ドライブシリンジからリン酸塩汚染物質をプリン、ヌクレオシド、ホスホリル、および7つのメチルギネで20分間インキュベートします。励起波長を425ナノメートルに設定し、PMT付きの450ナノメートルカットオフフィルターを使用して、M-D-C-C-C-P-B-P蛍光を検出します。

前述のように、ドライブシリンジにサンプルをロードします。データ収集パラメータを設定し、データを収集をクリックして、TPおよびM-D-C-C-C-P-B-Pモニターリン酸塩の放出とM-D-C-C-C-P-P-P蛍光の結合増加を混合するために、少なくとも5つの運動学的トレースを収集し、高品質のデータセットを取得し、ファイル平均の複数の運動学的トレースを保存し、前述のように分析のためにデータファイルをエクスポートします。リン酸塩濃度とM-D-C-C-P-P-P蛍光との間の線形関係を決定するための検量線を準備します 最初に、停止した流れの同じ実験条件下で、異なるリン酸塩濃度のM-D-C-C-P-P-Pを混合します。

次に、検量線の最大M-D-C-C-C-P-P-P蛍光と各リン酸塩濃度をプロットし、傾きを使用してマッシュのリン酸塩濃度を決定し、2つのマッシュ6反応でリン酸塩濃度と時間の関係をプロットし、データを指数関数と線形関数に適合させます。この機能は、研究前の状態A TP加水分解とリン酸塩放出のバーストと、それに続く反応の線形定常状態フェーズを表します。速度論的データは、マッシュ2マッシュ6がTPを加水分解し、最初の触媒ターンオーバーで毎秒1.4でリン酸塩を急速に放出することを示しています。

これに続いて、反応のゆっくりとしたステップが続き、その後のターンオーバーを毎秒0.2の7倍の遅い定常状態の触媒定数に制限します。しかし、マッシュからマッシュシックスがミスマッチDNAに結合すると、TP加水分解のバーストとリン酸塩の放出が抑制されます。これらの結果は、不整合な塩基対とDNAマッシュがあまりにも6つを結合すると、A TP結合状態に切り替わることを直接示しています。

このスイッチは、DNA修復反応における重要なステップです。ストップフロー装置を使用して、反応のアインをリアルタイムで測定する方法を紹介しました。このような測定により、MASH 2、MASH 6の作用機序、およびDNAミスマッチ修復の理解が進みました。

これらのタイプの実験を行う際には、非常に純粋なDNAやタンパク質を含む高定性薬剤を使用することを忘れず、ATPsアッセイでリン酸塩汚染を与えるために特別な注意を払うことが重要です。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。