移植绿色荧光蛋白表达对视网膜和大脑发育的实时成像嵌合斑马鱼胚胎的卵裂球

Blairs 是在发育的卵裂阶段形成的胚胎细胞。在这里，使用移植针将 GFP 标记的 Blair 从一个斑马鱼胚胎转移到另一个斑马鱼胚胎。这种方法允许通过实时显微镜成像来跟踪遗传背景改变的亵渎者的行为和命运，反之亦然。

嗨，我是匹兹堡大学眼科 Shawe 博士的实验室 Dr.Zoran。今天我们将向您展示斑马鱼 embr 中乳房脂肪团运输的程序。我们在实验室中使用该程序来研究视网膜和大脑发育。

那么让我们开始吧。晚上，设置斑马鱼的成对杂交以防止随机交配。在所需时间之前，使用隔板将雌鱼和雄鱼分开。这里。

表达 GFP 的转基因鱼被用作供体卵裂球的来源。PT 1 0 4 转基因系在 EF one 启动子的控制下普遍表达 GFP，以制备容纳胚胎的 agros 孔，将融化的 1% agros 倒入培养皿中。将带有楔形突起的塑料模具漂浮在 agros 溶液上。

然后让它冷却下来。要小心凝固，请去除霉菌并将 agros 床浸入 E 3 水中。接下来，准备移植针。

使用功率设置为 11.5 的垂直针式拉拔器拉动玻璃毛细管移液器。好的针尖应该随着长轴而逐渐变细。用微型研磨机以 45 度角研磨针尖，直到获得内径为 30 至 40 微米的斜面开口。

要清理针尖，请将软管连接到钝端，将软管连接到注射器，然后吸起并释放 10% 氢氟酸溶液。直到清除所有可见的碎屑。用蒸馏水清洗尖端。

然后用 100% 乙醇风干针头，直到所有乙醇蒸发。确保尖端完全干燥很重要。残留的乙醇会在高温抛光过程中损坏针头。

第二步，要软化和抛光针尖的粗糙边缘，用微型锻造机的细丝产生的热量烘烤它们。抛光时不要让针尖接触灯丝，要注意通过灯丝的电量以及灯丝与针之间的距离。可以调整吸头以达到所需的加热条件。

温度不宜太高。这将在粗糙的边缘变得光滑后使针尖熔化和变形。用针尖小心地触摸加热的细丝，然后轻轻地将细丝拉开，形成尖头。

锋利、光滑和干净的针头对于在不损坏宿主胚胎的情况下获得完整的供体冲击波至关重要。将玻璃移液管拉到气体火焰上，制成末端光滑的精细玻璃探针。该探针将用于在移植前将胚胎定位在正确的方向。

在实验当天，取下交叉盒中的隔板，让鱼交配。八。30 分钟后，将 100 到 200 个胚胎倒入网中，收集它们。将胚胎放入装满 E 三水的培养皿中。

然后使用细镊子，通过手动撕掉 COR 来剥落胚胎。然后使用带有弯曲轴的玻璃移液器小心地将涂层胚胎转移到 aros 孔中。不要让胚胎与空气接触，这会导致它们爆裂。

让胚胎在 28.5 摄氏度的 aros 井中发育，直到受精后 3 小时或 HPF 后胚胎发育。通过将移植针连接到充满矿物油的微型泵送系统来设置移植装置。确保系统没有泄漏并且没有任何残留的气泡。

用矿物油回填整个移植针，除了尖端开口处的 0.5 到 1 微升空间。从培养箱中取出胚胎，并将它们放在显微镜的载物台上以移植亵渎。使用玻璃定位探针将 3 到 4 个 HPF 胚胎的亵渎面向上定向。

然后将移植针轻轻插入供体胚胎中，慢慢将 5 到 20 个亵渎物吸入针头中，确保针尖在移植过程中不接触空气。将充满亵渎的针头插入宿主胚胎中，然后慢慢释放亵渎。亵渎者被释放的部位将影响它们的后代在后期发育阶段的定位位置，以分析动物极的视网膜和大脑发育释放细胞。

如果要分析其他组织和器官的发育，应相应地考虑不同的释放位置。为了尽量减少移植过程中的机械损伤，将宿主胚胎留在 28.5 摄氏度的 agros 井中，直到第二天。然后将镶嵌胚胎转移到预先涂有 0.5 毫升 1%aros 并填充 1 毫升 E 三蛋水的 24 孔板中。

应向每个孔中添加一个胚胎，以防止 10 微升 100 x 青霉素和链霉素的细菌感染。对于每个，称量并准备低熔点或 LMP aros，并将溶液保存在 30 摄氏度的水浴中。将马赛克胚胎转移到具有 0.17 毫米厚玻璃底的植物培养皿中。

去除多余的 E 三水，让胚胎刚好被覆盖。然后在 ARO 溶液凝固之前，以 30 至 50 微升熔化的 1.5% LMP 快速向胚胎中注入胚胎。将眼睛或大脑尽可能靠近玻璃底部。

溶液冷却后，添加额外的 agros 溶液以进一步将胚胎固定到位。将固化的 agros 块浸入 2 到 3 毫升 E three egg 水中，用于共聚焦显微镜检查。使用具有大焦深的 40 倍水浸倒置物镜。

在物镜上滴一滴水，将植物培养皿组织培养皿放在载物台上，聚焦图像显影。通过每 5 分钟拍摄一次胚胎照片来进行延时成像。根据实验的性质，可以调整拍摄之间的时间间隔。

这里显示了一条 24 HPF seber 鱼的代表性图像。GFP 表达以绿色突出显示供体细胞。视网膜神经上皮细胞跨越视网膜壁的整个厚度。

这部电影展示了宿主大脑中供体细胞在 24 HPF 下的运动。请注意细胞形态随时间而变化。只需向您展示如何进行斑马鱼的乳房镜运输。

进行此程序时，请务必记住在移植乳房区域轻轻准备一根好的针头。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。