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생물학적 기술
0 조회수 • 3:12 분 • July 8th, 2025
관심 유전자 옆에 있는 LoxP 부위(Cre-재조합효소에 의해 인식되는 특정 서열)를 포함하는 변형된 게놈으로 구성된 유전자 조작 마우스 모델로 시작합니다. 마우스는 장기 특이적 CreER 재조합효소를 암호화하는 플라스미드 벡터로 추가로 형질감염되어 CreER 재조합효소 발현 요소를 간 세포의 게놈에 통합합니다.
발현된 CreER 재조합효소는 Cre 재조합효소와 에스트로겐 수용체인 ER의 돌연변이 리간드 결합 도메인을 포함하는 비활성 융합 단백질로, 세포질의 열충격 단백질과 상호 작용하고 결합합니다. 이 결합은 세포질에 CreER 재조합효소를 제한합니다.
에탄올과 적절한 오일을 사용하여 소수성 약물인 타목시펜 용액을 준비합니다. 이제 복부 장기의 손상을 방지하기 위해 타목시펜 용액을 마우스 복부의 왼쪽 하부 사분면에 복강 내 주입합니다.
주입된 타목시펜은 간에서 4-하이드록시타목시펜, 4-OHT로 대사됩니다. 또한, 선택적 에스트로겐 수용체 조절제인 4-OHT는 CreER 재조합효소의 ER-리간드 결합 도메인에 결합하여 형태 변화를 일으킵니다. 이것은 열충격 단백질에서 CreER 재조합효소의 방출로 이어집니다.
활성화된 CreER 재조합 분해제는 핵으로 전좌하고 숙주 게놈의 LoxP 부위를 인식합니다. CreER 재조합제는 LoxP 부위 간의 부위 특이적 재조합을 촉매하여 관심 유전자를 절제하여 조직 특이적 유전자 녹아웃을 달성합니다.
꼬리 정맥 주사 후 10-15일 후에 Cre Recombinase의 유도를 시작하여 통합되지 않은 벡터를 제거할 수 있습니다. 타목시펜 10mg을 에탄올 40마이크로리터에 녹이고 교황하면서 섭씨 55도에서 10분 동안 배양합니다.
타목시펜이 녹을 때까지 여러 번 소용돌이치고 옥수수 기름 960마이크로리터를 넣고 섭씨 55도에서 5분 동안 배양합니다. 냉각 후 용액을 20게이지 바늘이 있는 1밀리리터 인슐린 주사기에 넣은 다음 27게이지 바늘로 변경합니다.
주사하려면 먼저 엄지손가락과 두 번째 손가락으로 마우스의 목을 조심스럽게 잡고 손바닥과 네 번째, 다섯 번째 손가락 사이에 꼬리를 고정하여 마우스를 목덜미로 만든 다음 복부 왼쪽 아래 사분면에 0.1 ml의 용액을 복강 내 주입합니다.
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