Phagocytosis Assay: Drosophila melanogaster의 배아 세포에서 세포사멸 세포 삼킴을 시각화하는 면역염색 기술

대식세포는 식균 작용에 의한 프로그램된 세포 사멸인 세포사멸을 겪는 세포를 제거하는 특수 면역 세포입니다.

세포사멸 세포 삼킴을 평가하려면 혈구(무척추동물 대식세포)에 의해 삼켜진 세포사멸체를 포함하여 고정된 초파리 배아 세포가 포함된 유리 슬라이드로 시작합니다.

먼저, 비특이적 부위를 차단하는 차단 시약으로 세포를 처리합니다. 혈구의 식세포 마커인 크로크모트 수용체에 결합하는 1차 항체를 추가합니다. 과도한 항체를 씻어냅니다.

1차 항체에 결합하는 알칼리성 포스파타제 표지 2차 항체를 추가합니다. 이제 슬라이드에 적절한 발색 기질 용액을 추가하고 배양합니다. 배양하는 동안 알칼리성 포스파타제는 발색 기질과 반응하여 혈구에 보라색으로 염색된 과립을 생성합니다.

다음으로, 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제, TdT 효소 및 디곡시게닌 결합 뉴클레오티드를 포함하는 반응 혼합물을 첨가합니다. TdT는 세포사멸체에서 단편화된 DNA의 노출된 3' OH 말단에 디곡시게닌 결합 뉴클레오티드의 부착을 촉매합니다.

다음으로, DNA 손상 부위의 뉴클레오티드에 결합하는 과산화효소 리포터에 접합된 항-디곡시게닌 항체를 추가합니다. 과산화효소 특이적 발색 기질 용액으로 세포를 처리하고 배양합니다. 과산화효소는 기질의 산화를 촉매하여 유색 침전물을 생성하고 세포사멸체를 갈색으로 염색합니다.

마지막으로 광학 현미경으로 세포를 시각화합니다. 보라색 과립과 세포의 갈색 신호의 공존은 식균된 세포사멸체를 포함하는 혈구를 나타냅니다.

항-크로크모트 항체로 세포를 면역염색하려면 먼저 슬라이드를 메탄올에 연속적으로 담근 다음 0.2% Triton X-100을 보충한 PBS를 담근 다음 PBS 단독을 담근다. 다음으로, 실온에서 20분 동안 PBS + 0.2% Triton X-100에 5% 전체 돼지 혈청 20마이크로리터로 비특이적 결합을 차단합니다. 과도한 차단 용액을 제거하고 밤새 섭씨 4도에서 20마이크로리터의 항-크로크모트 항혈청으로 세포에 라벨을 붙입니다.

다음날 아침, PBS + Triton X-100에서 슬라이드를 세척하여 10분 동안 5회 배양합니다. 마지막 세척 후 슬라이드를 PBS로 10분 동안 헹굽니다. 그런 다음 실온에서 1시간 동안 20마이크로리터의 알칼리성 포스파타제 표지 항쥐 IgG로 세포를 표지합니다.

배양이 끝나면 시연된 대로 슬라이드를 PBS + Triton X-100에서 5회 세척한 다음 완충 용액에 10분 동안 담가둡니다. 그런 다음 포스파타제 기질 용액으로 세포를 표지하고 광학 현미경으로 세포를 관찰합니다.

혈구 과립에 강한 보라색 신호가 나타나면 여분의 기질을 제거하고 슬라이드를 EDTA가 보충된 완충액에 5-10분 동안 담가둡니다. 배양이 끝나면 세포를 5분 PBS 세척 2회로 헹구고 평형 완충액으로 10분 동안 처리합니다.

용액을 제거한 후, 섭씨 37도에서 1시간 동안 20마이크로리터의 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 용액으로 세포를 표지합니다. 그런 다음 슬라이드에서 용액을 제거하고 세포를 17밀리리터의 물에 17밀리리터의 세척 완충액을 10분 동안 담그십시오. 다음으로, 3번의 5분 PBS 세척으로 세포를 헹구고 실온에서 30분 동안 20마이크로리터의 항디곡시게닌 퍼옥시다아제로 라벨링합니다.

배양이 끝나면 시연된 대로 PBS에서 세포를 4회 세척하고 세포사멸 세포가 갈색으로 변할 때까지 슬라이드를 과산화효소 기질에 30초 단위로 담그십시오. 최적의 염색이 달성되면 슬라이드를 물에 담가 과산화효소 반응을 멈춥니다.