Preparazione dei tendini coda di topo per studi di biomeccanica e Mechanobiological

Il video che state per vedere contiene le procedure sperimentali utilizzate per isolare e preparare il tendine della coda di ratto per studi biomeccanici e di biologia meccanica. Lo scopo di questo articolo è quello di dimostrare i metodi e gli strumenti che sono stati sviluppati e ottimizzati al fine di mantenere la vitalità, la sterilità e l'integrità dei tessuti alla procedura di preparazione. Discuteremo diverse caratteristiche riguardanti le fasi principali della preparazione, a partire dall'estrazione, seguita dalla misurazione dell'area della sezione trasversale, dal risciacquo e infine dal caricamento nella camera del bioreattore.

Iniziamo. L'estrazione è la prima fase della preparazione al fine di preservare la vitalità cellulare. Tutte le sue manipolazioni vengono eseguite in soluzione di seline fredda.

Dopo la ratti izzazione, la coda viene resecata, sciacquata con etanolo al 70% e trasferita in una capsula contenente cellula e soluzione e mantenuta in ghiaccio. Per facilitare l'estrazione del tendine, la pelle deve essere rimossa. Tenendo conto che lavoriamo con i tendini ventrali.

Poiché sono più piccoli e più facili da manipolare con la nostra attrezzatura, viene praticata un'incisione lungo tutto il lato dorsale della coda. Il corretto orientamento della coda viene quindi verificato osservando l'anatomia all'estremità prossimale. Come possiamo vedere, il lato ventrale mostra un numero maggiore di tendini e la presenza di un vaso sanguigno può essere verificata dalle gocce di sangue ottenute.

Quando si stringe delicatamente la coda, si realizza l'incisione. Partendo dall'estremità prossimale e utilizzando un paio di forbici chirurgiche. Si fa attenzione a manipolare la coda con le sue estremità.

Al termine dell'incisione, la pelle viene rimossa, partendo anche dall'estremità prossimale utilizzando le dita o una pinza. Ancora una volta, si presta attenzione a manipolare la coda dalle sue estremità. Successivamente, la coda viene risciacquata nella soluzione per rimuovere peli e sangue.

Il campione viene quindi trasferito in una capsula contenente una soluzione fresca e conservato in ghiaccio. A questo punto, lo sperimentatore cambia i guanti per esporre il tendine. L'estremità distale della coda è resecata due o tre vertebre più corta.

Le vertebre sono i fasci visibili tra i fasci tendinei e possono anche essere sentite quando si fanno scorrere le dita lungo tutta la coda. Una vista al microscopio ottico di una sezione trasversale realizzata lungo la vertebra. L'estremità skoal mostra che ci sono sei diversi gruppi tendinei poiché il tendine di ciascuno di essi è attaccato alla vertebra e che stiamo usando solo i tessuti ventrali.

Ad ogni taglio vengono estratti quattro tendini, due dai gruppi inferiori e due dai gruppi laterali. Per realizzare la resezione, è possibile utilizzare una cesoia chirurgica per rompere il disco intervertebrale e un bisturi su un tagliere per i tessuti molli. A questo punto, il lato ventrale si riconosce per la presenza di un tendine più grande.

Una volta verificato l'orientamento, il tendine viene estratto delicatamente dall'estremità distale utilizzando una pinza quando non è più possibile estrarre i tessuti, la coda viene resecata sulla spalla vertebrale come mostrato in precedenza. Dopo l'estrazione, il tessuto viene immediatamente immerso nella soluzione e, tenendo entrambe le estremità, il tendine viene trasferito in una piastra di manipolazione contenente anche la soluzione cellulare e sulla quale viene utilizzato del nastro adesivo per identificare l'estremità prossimale. Un'analisi microscopica della sezione longitudinale contaminata da h ed e mostra che, utilizzando questo metodo semplice e ripetitivo, il sigillo tissutale estratto ha una rete di collisione ben foderata e densamente compatta.

Dopo la manipolazione, quando i tessuti subiscono una stimolazione meccanica, descriviamo le loro proprietà meccaniche normalizzando la forza all'interno allo stress. Pertanto, dobbiamo valutare la loro area della sezione trasversale. A tal fine, il profilo dell'inquilino viene ricostruito utilizzando una stereoscopia dotata di fotocamera digitale.

Con questo metodo, l'integrità dei tessuti viene preservata poiché il carico di neve o lo stress vengono applicati direttamente ad esso. La fotocamera digitale scatta foto della proiezione dell'inquilino oltre 180 visualizzazioni. All'interno di un sistema di riferimento, un algoritmo di assistente visiva localizza i bordi superiore e inferiore del campione.

Successivamente viene utilizzato un algoritmo con software MATLAB per effettuare la ricostruzione del profilo. Un micrometro ottico è stato progettato per mantenere il tessuto nella zona focale. Poiché al di fuori di questa regione, la proiezione è sfocata e la rifocalizzazione sposterebbe il sistema di riferimento locale.

Il micrometro include un vano di misurazione per prevenire la disidratazione dei tessuti. Due sistemi di posizionamento con stadio rotante, che consentono la rotazione del provino e due dispositivi di ancoraggio realizzati con tubi in silicone compressi contro i colori dell'albero. Innanzitutto, il vano di misurazione viene riempito con una soluzione di cella fredda fino a quando l'ingresso di un tubo di silicone non viene sommerso.

Quindi l'astronauta viene trasferito nel vano di misurazione utilizzando una pinza e tenendo solo le sue estremità. Utilizzando un micro volume di DPI, le estremità tendinee vengono aspirate tramite sezione nei tubi di silicone. L'aspirazione viene quindi eseguita fino a quando l'estremità non si estende oltre i colori dell'albero.

Una volta terminati entrambi i lati, i colori dell'albero vengono serrati utilizzando una chiave del manico per comprimere il tubo. Ora che il tendine è riparato, l'apparecchio è installato sotto la coppa del microfono stereo. Il tendine può essere osservato direttamente dallo schermo del computer con un ingrandimento di 105.

Per coerenza, il tendine viene allungato fino a quando le pieghe non sono più percettibili, seguito da un'ulteriore deformazione dello 0,4%. Poiché il campione è raffigurato da zero a 170 gradi, la posizione iniziale e la messa a fuoco sulla regolazione sono necessarie per ottenere un'immagine chiara su tutta la circonferenza. Infatti, vengono scattate 18 foto in cui la rotazione del campione viene aumentata di 10 gradi tra ogni vista.

Con questo metodo, è possibile stimare l'area della sezione trasversale di un tendine della coda di ratto senza danneggiare il tessuto. Alla fine, si ottiene una ricostruzione del profilo con un margine di errore compreso tra lo 0,5 e il 2%. Dopo la misurazione, i tessuti vengono risciacquati per evitare contaminazioni che potrebbero essersi verificate durante le manipolazioni precedenti.

Nell'armadio vengono posizionate piastre di manipolazione sterili contenenti una soluzione di fissaggio fresca, una utilizzata per la procedura di risciacquo mentre l'altra riceverà il tendine di risciacquo. Lo sperimentatore lava il suo guanto con etanolo al 70% prima di introdurre il tendine estratto nella cabina di biosicurezza. Tenendo solo le estremità, il tendine viene trasferito con cura da un pozzetto all'altro.

Infine, viene trasferito in una piastra di manipolazione individuale contenente anche una soluzione cellulare sterile. Per la convalida del protocollo, abbiamo condotto test di vitalità e sterilità. La prima vitalità cellulare è stata valutata utilizzando un kit di citotossicità di vitalità vivo morto per cellule di mammifero.

Dopo una coltura di 12 giorni, è stata visualizzata la maggior parte delle cellule vive fluorescenti verdi, confermando che le procedure di isolamento hanno avuto successo nel preservare il tessuto vivo. Sono stati quindi condotti esami per verificare la contaminazione della coltura utilizzata. Il terreno è stato placcato su agar e incubato per 10 giorni poiché non è stata osservata alcuna crescita batterica.

Abbiamo fatto in modo che le nostre manipolazioni siano sterili. L'uso del sistema di ancoraggio sfrutta il vantaggio della disidratazione dei tessuti e la colla per piccoli campioni come coda di topo, tendini, la colla penetra nel tessuto. Questo è il problema in tutte le subunità, mentre la disidratazione migliora le sue proprietà meccaniche per evitare ulteriori contaminazioni.

Tutta la procedura di caricamento viene eseguita in una cabina di biosicurezza in cui tutti i componenti dello strumento e della camera sono sterili. Per l'operazione di caricamento, la camera del bioreattore è fissata su una maschera di posizionamento. Due bracci mobili sono predisposti per ricevere gli ancoraggi dei tendini.

Un coperchio chiude la camera per evitare contaminazioni. Innanzitutto, gli ancoraggi vengono depositati sulle estremità della piastra di manipolazione. Le loro bobine sono centrate con l'asse longitudinale della scanalatura e sopra il tendine.

Il tendine viene quindi avvolto e attorno a un'ancora. L'ancora viene fatta rotolare per circa tre quarti di giro mentre il corpo del tessuto rimane nella soluzione. Tenendo l'estremità libera, assicuriamo l'attaccamento del tessuto all'ancoraggio.

La stessa procedura viene poi ripetuta per l'altra estremità. Una volta che entrambi i lati sono stati fissati, le ancore vengono arrotolate o srotolate allo stesso modo fino a quando non ci sono sei centimetri. Tra le due estremità, due gocce da 2,5 microlitri di ocreate si depositano sulla parte ferita dei tendini.

Per entrare in adesione si fa attenzione. Per evitare di mettere la colla nella soluzione cellulare, sono necessari almeno cinque minuti affinché la colla si asciughi completamente. Per convalidare il nostro protocollo, abbiamo condotto test per verificare l'influenza della colla e della disidratazione del punto di ancoraggio sulla vitalità del tessuto.

Dopo due ore, abbiamo osservato che la condizione dell'estremità non si era diffusa senza il tessuto. In effetti, c'è un limite di colore ben definito che segna il confine delle cellule morte fluorescenti rosse che si trovano nel punto di ancoraggio e la maggior parte delle cellule vitali verdi del corpo del tessuto. Nel frattempo, la camera del bioreattore è riempita con terreni di coltura freschi.

Una volta che la ferita di una parte del tendine è asciutta, viene reidratata con soluzione cellulare. Quindi il tessuto ancorato viene trasferito nella camera utilizzando una pinza. Il coperchio è chiuso per evitare ulteriori contaminazioni.

La maschera di posizionamento verrà rimossa una volta installata la camera nel bioreattore. Abbiamo appena dimostrato come preparare un tendine della coda di topo per studi biomeccanici e di biologia meccanica. Applicando queste procedure, possiamo condurre un'ampia varietà di studi in vitro su questi tessuti.

Ad esempio, uno studio sulla degenerazione tissutale è stato condotto mediante l'applicazione di sottostimolazione per un periodo di 10 giorni. Ogni giorno abbiamo valutato il tessuto, le proprietà meccaniche e il test di rilassamento dello stress non distruttivo. Alla fine, siamo stati in grado di osservare la variazione dello stress.

Abbiamo dimostrato che le nostre rigorose procedure di isolamento e preparazione consentono di mantenere la vitalità, la vitalità e l'anti. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.