감염된 마우스의 장기에서 바이러스 역가를 정량화하기 위한 초점 형성 분석

포유류 세포의 단층이 포함된 멀티웰 플레이트를 가져 가십시오.

감염된 마우스의 다른 기관에서 파생된 지카 바이러스를 포함하는 조직 균질의 연속 희석액으로 웰에 접종합니다.

엔도사이토시스를 통해 세포에 들어가면 바이러스는 증식하고 싹을 틔워 인접한 세포를 감염시킵니다.

고점도 메틸셀룰로오스 용액을 겹쳐 바이러스 이동을 제한하는 물리적 장벽을 만듭니다.

장벽은 바로 인접한 세포의 감염만 허용하여 감염된 세포의 병소를 형성하고 각 초점이 단일 바이러스 입자에서 유래하도록 하여 정확한 정량화를 가능하게 합니다.

세포를 고정하고 막을 투과화합니다. 세포에 들어가 바이러스 항원과 상호 작용하는 1차 항체를 추가합니다.

1차 항체에 결합하는 과산화효소 접합 2차 항체를 도입합니다.

과산화효소에 의해 전환되어 감염된 세포의 병소를 나타내는 유색 반점을 생성하는 발색 기질을 추가합니다.

마우스의 다른 기관에서 바이러스 역가를 정량화하기 위해 병소를 계산합니다.

씨 영하 80도의 냉동고에서 균질화된 샘플을 꺼내 해동시킵니다. 얼음 위에 샘플을 놓고 지카 바이러스를 희석 플레이트의 첫 번째 웰에 10배 희석하고 다중 채널 피펫을 사용하여 플레이트 아래로 10배 연속 희석을 수행하고 20마이크로리터의 샘플을 180마이크로리터의 성장 배지에 추가하여 매번 팁을 변경합니다.

각 희석 사이에 피펫 팁을 교체하십시오. Vero 세포를 덮고 있는 준비된 평평한 바닥 96웰 플레이트에서 배지를 제거하여 초점 형성 플레이트를 준비합니다. 단층이 건조되는 것을 방지하려면 Vero 플레이트의 각 웰에 즉시 100마이크로리터의 바이러스 희석액을 추가합니다. 동일한 팁 세트를 사용하여 가장 낮은 농도에서 가장 높은 농도로 추가합니다.

암석판을 좌우로 2-4회 배치하고 섭씨 37도와 이산화탄소 5%에서 1-2시간 동안 배양합니다. 2% 메틸셀룰로오스를 실온으로 예열합니다. 그런 다음 성장 배지에서 2% 메틸셀룰로오스 용액을 약 2:1의 비율로 희석합니다. 배양 후, 125마이크로리터의 메틸셀룰로오스 성장 배지를 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가합니다. 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 32-40시간 동안 다시 배양합니다.

Vero 세포를 고정하려면 생물 안전 캐비닛에 96웰 플레이트의 각 웰에 있는 메틸셀룰로오스 층 상단에 50마이크로리터의 5% 파라포름알데히드를 추가합니다. 실온에서 60분 동안 배양합니다. 또는 플레이트를 파라필름으로 덮고 밤새 섭씨 4도에서 놓습니다.

그런 다음 피펫을 사용하여 세포에서 오버레이와 배지를 생물 안전 캐비닛 내부의 일회용 용기로 제거합니다. 웰당 150마이크로리터의 PBS로 부드럽게 세척합니다. 플레이트에서 PBS를 제거하고 생물 안전 캐비닛에서 플레이트를 제거합니다. PBS 세척을 두 번 반복합니다. 그런 다음 웰당 150마이크로리터를 FFA 세척 완충액 1회 첨가하고 실온에서 5-10분 동안 방치하여 고정 세포를 투과화합니다.

다음으로 1차 지카 항체를 사용하여 감염을 감지합니다. FFA 염색 완충액에서 밀리리터당 1마이크로그램의 농도로 1차 항체 4G2를 준비합니다. 플레이트에서 FFA 세척 완충액을 튕기고 FFA 염색 완충액에 있는 1차 항체 50마이크로리터를 각 웰에 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 파라필름이나 플라스틱 필름으로 밀봉하고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.

FFA 염색 완충액에서 1 내지 5,000의 농도로 2차 염소 항마우스 HRP-표지 항체를 제조한다. 항체 용액을 제거한 후, 웰당 150마이크로리터 FFA 세척 완충액으로 세포를 세 번 세척합니다. 매번 싱크대에 쓸어 넣어 세척 완충액을 제거합니다.

FFA 염색 완충액에서 2차 항체로 세포를 웰당 50마이크로리터로 염색하고 실온에서 1-2시간 배양합니다. 그 후, 세포를 FFA 세척 완충액으로 다시 세 번 세척하고, 매번 싱크대에 튕겨 세척 완충액을 제거합니다.

각 웰에 50마이크로리터의 Trueblue 기질을 추가합니다. 최소한의 배경으로 스팟이 완전히 정의될 때까지 2-15분 정도 기다립니다. 반점이 보이면 손을 사용하여 물로 부드럽게 씻어 물이 흐르는 힘으로부터 단층을 보호하십시오. 종이 타월로 천문질러 말립니다.

얼마 지나지 않아 해부 스코프를 사용하여 각 우물의 지점을 수동으로 계산하거나 자동 지점 카운터를 사용합니다. 면역 포획 소프트웨어에서 각 샘플에 대해 웰당 20에서 200 사이의 쉽게 구별되는 병소가 있는 희석액을 선택하고 중복 웰의 평균을 사용하여 밀리리터당 초점 형성 단위로 역가를 계산합니다.