유전자 변형을 사용하여 시금 β - 아밀로이드 독성 C. 엘레간스 모델

다음 실험의 전반적인 목표는 InVivo 모델 시스템에서 베타 아밀로이드 펩타이드의 독성을 분석하는 것입니다. 이 분석법은 재현성이 높고 상대적으로 간단하여 베타 아밀로이드 독성에 대한 약물, 환경 조건 또는 유전자 변형을 빠르게 테스트할 수 있습니다. 이 분석법 개발의 핵심 요소는 베타 아밀로이드 펩타이드의 근육 특이적 온도 유도성 발현이 가능한 형질전환 cl egan's worms를 생성하는 것입니다.

이 온도 민감성 발현은 비정상적으로 긴 3' 비번역 영역(untranslated region)을 포함하는 외래유전자를 구축하여, 외래유전자 mRNA가 mRNA 감시 체계의 표적이 되도록 설계되었습니다. 따라서 mRNA 감시 체계가 정상적으로 작동하는 야생형 벌레에서는 외래유전자 mRNA의 분해로 인해 해당 외래유전자의 발현이 낮게 나타납니다. 만약 이 외래유전자가 mRNA 감시 체계의 필수 구성 요소에 돌연변이가 있는 유전적 배경으로 도입되면, 외래유전자의 발현이 현저히 높아집니다. 유전적 배경에 mRNA 감시 체계의 온도 민감성 돌연변이가 포함되어 있다면, 비허용 온도에서 이 외래유전자 도입 균주를 증식시킬 때 외래유전자 mRNA의 분해가 차단되어 높은 외래유전자 발현이 유도됩니다. 이 시스템을 이용하여 체벽 근육에서 베타 아밀로이드 펩타이드의 발현을 조절하는 외래유전자 도입 벌레의 경우, 온도를 16 °C에서 25 °C로 올리면 베타 아밀로이드 펩타이드가 다량 축적되어 근육 세포의 기능 장애와 벌레의 마비가 발생하며, 그 소요 시간을 측정합니다.

온도 상승 후 이러한 형질전환 벌레 집단이 마비되는 데 걸리는 시간을 측정하는 것은 베타 아밀로이드 독성에 대한 민감한 분석법입니다. 이는 마비 분석을 위해 신선한 nematode growth media 플레이트를 제작함으로써 달성되며, 이를 통해 마비율에 영향을 줄 수 있는 환경 변수를 최소화할 수 있습니다.

두 번째 단계로, 연령이 동기화된 트랜스제닉(transgenic) 벌레 집단을 준비하며, 이는 발달 단계가 트랜스진 발현에 미치는 영향을 최소화하기 위함입니다. 다음으로, 동기화된 3기 유충(third larval stage)을 16 °C에서 25 °C로 온도를 높여 트랜스진 mRNA의 안정성을 높이고 베타 아밀로이드 펩타이드의 축적을 유도합니다. 각 벌레의 온도 상승 시점부터 마비가 일어날 때까지의 시간을 측정하여 근육 기능 장애의 속도를 파악함으로써, 베타 아밀로이드 펩타이드 축적의 독성 효과를 분석합니다. 이를 통해 내인성으로 발현된 베타 아밀로이드 펩타이드의 독성에 특정 처리가 미치는 영향에 대한 결과를 얻습니다.

약물 활성을 분석하기 위해 형질전환 마우스 모델을 사용하는 것과 비교했을 때, 저희 기술의 주요 장점은 훨씬 더 빠르게 그리고 훨씬 더 저렴한 비용으로 수행할 수 있다는 점입니다. 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 마비 분석 실험에서 L4 단계 벌레의 점수를 매기는 법은 익히기가 매우 어렵기 때문입니다.

따라서 마비된 L4 단계의 벌레를 평가할 때는 벌레 머리 부분의 분리된 후광 운동(halo movement)을 관찰해야 합니다. 벌레의 전신은 마비된 상태에서 머리 부분만 움직이는 경우, 해당 벌레를 마비된 것으로 판정합니다. 마비 분석법은 C. elegans의 증식 및 유전학 연구에 일상적으로 사용되는 표준 선충 성장 배지(NGM) 플레이트에서 수행됩니다.

플레이트를 준비하려면 염화나트륨, 한천, 펩타이드가 포함된 NGM 용액을 삼각 플라스크에 넣고 오토클레이브로 멸균한 후, 동봉된 서면 프로토콜에 기재된 적절한 양의 멸균 용액들을 추가합니다. 액상 NGM 10 milliliters를 60 millimeter by 15 millimeter 페트리 접시에 각각 분주합니다. NGM이 실온에서 하룻밤 동안 굳도록 둡니다.

화합물이나 추출물의 효과를 테스트하는 경우, 추출물을 각 플레이트에 분주하고 스프레더를 사용하여 플레이트 표면에 고르게 도포합니다. 플레이트를 실온에서 하룻밤 동안 건조시킵니다. 1 mL 이상의 부피는 건조하는 데 더 많은 시간이 소요됩니다.

다음으로, LB 배지에서 하룻밤 동안 배양하여 광학 밀도(optical density) 0.4에서 0.6이 된 E. coli strain OP 50 250 µL를 각 플레이트에 스팟팅하고, 상온에서 하룻밤 동안 박테리아를 건조시킵니다. 플레이트의 제작 시점은 마비율에 상당한 영향을 미치며, 오래된 플레이트일수록 건조해지는 경향이 있습니다. 플레이트는 마비 분석(paralysis assay) 실시 전 1주일 이내에 제작해야 합니다.

이상적으로는 동기화된 산란을 위해 3~4일 전에 배양된 플레이트를 사용하는 것이 좋습니다. 실험에 사용되는 모든 플레이트는 동일한 배치에서 준비되어야 하며, 로(lawn)의 크기나 박테리아를 변경하면 벌레의 행동 또한 변하게 됩니다. 마비 분석은 다른 E. coli 균주를 사용하여 수행할 수 있습니다. 예를 들어, RNAi 실험에서는 HT115가 사용됩니다. 하지만 이는 마비 분석의 역학을 변화시킬 수 있습니다.

따라서 해당 균주에 적합한 내부 대조군을 사용해야 합니다. beta 유도 마비를 분석하는 데에는 CL 476 균주가 가장 일반적으로 사용됩니다. 이 균주와 다른 형질전환 모델들은 Saint Ahadi Genetic Center에서 소정의 비용으로 학술 연구자들이 이용할 수 있습니다.

시험 집단의 연령 동기화를 최대화하기 위해, 동기화된 부모 세대부터 시작하는 것이 바람직합니다. 시험 집단의 마비 분석을 시작하기 일주일 전, 백금선 웜 피커를 사용하여 성체 20~30마리를 여러 개의 10 centimeter NGM 플레이트에 옮깁니다.

CL 4 1 76의 허용 온도인 16 °C에서 2시간 동안 OP 50과 함께 도말하여 알을 낳게 합니다. GR 성체를 제거하고 후손이 7일 동안 성장하도록 하며, 이 시점이 되면 이들은 2일 차 중년 성체가 됩니다. 2일 차 중년 성체.

각 실험 조건에 맞는 연령 동기화된 테스트 집단을 준비하기 위해 성체 웜을 사용합니다. 목적은 백금선 웜 피커를 사용하여 연령이 동기화된 웜 50~75마리가 포함된 플레이트를 3반복으로 제작하는 것입니다. 1~2일 된 성체 웜 10~12마리를 OP 50이 도말된 60 mm NGM 플레이트로 옮깁니다. 웜이 16 °C에서 2시간 동안 알을 낳도록 한 다음, 성체를 제거하고 알이 16 °C에서 부화하여 성장하도록 합니다.

이 단계에서는 플레이트를 평가하지 않을 사람이 코딩을 수행하여 평가자가 실험 조건을 알 수 없도록 블라인드 처리하는 것이 가장 좋습니다. 알이 산란되는 배아 발달 단계(최적 조건의 야생형 벌레의 경우 약 26 세포 단계)는 성체의 연령과 영양 상태에 따라 달라집니다. 산란에 사용된 성체가 너무 오래되었거나 굶주린 상태라면 더 후기 단계의 알이 산란되어 동기화된 개체군을 형성할 수 없으며, 이는 마비 분석의 역학에 영향을 미치게 됩니다.

어떠한 종류의 세균 오염이라도 이 분석에 심각한 영향을 미칠 수 있으므로, e coli OP 50과 같은 단일 균주 세균 배양물을 사용하는 것이 필수적입니다. 삼중 반복 플레이트의 벌레 수가 비슷할 때 재현성이 가장 높습니다. 트랜스진을 유도하고 마비 분석을 수행하려면, 플레이트의 온도를 25 °C로 올리십시오.

동기화된 산란이 끝난 지 48시간 후에 벌레는 3단계 유충 상태여야 합니다. 플레이트가 이 온도에 도달할 수 있도록 25 °C 인큐베이터에 겹치지 않게 배치하십시오. 동시에, 온도 상승이 시작된 후 18~20시간부터 벌레의 마비 상태를 점수화하기 시작하십시오.

이 시점에서 집단의 모든 벌레는 4단계 유충 단계에 도달해야 하며, 각 플레이트의 모든 벌레가 마비될 때까지 2시간 간격으로 측정을 계속하십시오. 알 수 없는 이유로 마비는 몸 전체에 걸쳐 균일하게 일어나지 않습니다. 머리 영역은 벌레의 움직임이 가장 마지막으로 멈추는 부분입니다.

따라서 최근에 마비가 시작된 벌레는 플레이트 전체를 가로질러 이동할 수는 없지만, 머리를 움직일 수는 있으며, 이에 따라 전단부 주변의 박테리아를 제거하여 박테리아가 제거된 헤일로(halo)를 남기게 됩니다. 이러한 벌레들은 예외 없이 완전히 마비되므로, 헤일로가 있는 벌레는 마비된 것으로 간주합니다. 일부 벌레는 헤일로가 없으면서 자발적인 움직임 또한 보이지 않을 수 있습니다.

웜 피커(worm picker)로 자극하여 이를 테스트합니다. 자극을 받은 웜이 전신 파동 전파(full body wave propagation)를 일으키지 못하는 경우, 효율적인 점수 산정을 위해 마비된 것으로 판정합니다. 마비된 웜을 플레이트의 표시되지 않은 구역으로 이동시키면, 다음 판정 기간에 실수로 다시 점수가 매겨지는 것을 방지할 수 있어 편리합니다.

이는 잘못 분류된 벌레들이 움직임을 보일 수 있게 하여, 점수 교정을 통해 마비 곡선을 생성할 수 있도록 합니다. 각 시점에서 각 플레이트 내 마비되지 않은 벌레의 분율을 백분율로 변환하며, 평균 비마비 백분율을 온도 상승(upshift)이 시작된 시점부터의 시간으로 도식화합니다. 결과적으로 생성된 곡선은 형태적으로 생존 곡선과 유사하므로 표준 비모수 생존 통계법을 사용하여 분석할 수 있습니다.

마비가 시작되려면 형질전환 myo-3 A$\beta$ 벌레의 상향 이동(upshift)을 L4 단계 중반까지 완료해야 합니다. Myo-3 프로모터는 발달 과정에 따라 조절됩니다. 벌레가 L4 후기 또는 성체 단계에 도달하면 발현 수준이 현저히 감소합니다.

웜이 굶게 되면 외래 유전자의 발현이 차단되므로, 실험 전 과정 동안 웜에게 충분한 먹이를 제공하는 것이 매우 중요합니다. 마비된 웜이 어떤 조건에서도 회복되는 사례는 관찰된 적이 없습니다. Upshift 후 12~16시간이 지나면 CL 41 76은 마비되며, 설령 온도를 16°C로 downshift 하더라도 마비가 일어납니다. CL 41 76 균주에서는 마비를 유발하는 외래 유전자의 발현 상향 조절이 더 낮은 온도에서도 발생할 수 있습니다.

하지만 마비율의 발생 시점에는 차이가 있을 수 있음을 유의하시기 바랍니다. 마비율은 사용되는 특정 트랜스진 계통에 따라 달라집니다. 본 연구진은 CL 41 76보다 마비율이 더 빠르거나 느린 세 가지 myo A beta 계통을 제작하였으므로, 이에 맞춰 마비 분석의 평가 시간 범위를 조정해야 합니다.

여기에 처리하지 않은 군과 6.27 millimolar caffeine에 노출시킨 군 모두에 대한 CL 4 1 76의 마비 곡선 그래프가 제시되어 있습니다. 이러한 처리는 마비 시점을 약 4시간 정도 상당히 통계적으로 유의미하게 지연시켰으며, 이는 beta 독성의 억제를 나타내는 것으로 해석됩니다. 이 모델에서, 본 실험은 커피에서 발견되는 또 다른 화합물의 효과를 분석하였습니다.

이 그래프는 베타 독성에 영향을 주지 않는 처리군에서 전형적으로 나타나는 양상입니다. 두 실험 모두에서 처리하지 않은 CL 4 1 76 집단의 약 절반이 24시간에 마비되었으며, 28시간에는 마비가 완전히 진행되었음에 유의하십시오. 이는 대조군의 마비에 있어 전형적인 시간 범위입니다.

CL 4 1 7 6 집단에서 이 시기와의 유의미한 편차는 환경 조건의 변화나 transgene 복제본의 자발적 결실을 나타냅니다. 균주 CL 4 1 76에 관한 추가 정보는 동봉된 프로토콜을 참조하십시오. 이 절차를 수행할 때는 플레이트의 사용 기간, 벌레 집단의 단계, 그리고 벌레의 마비율을 측정하는 능력을 염두에 두는 것이 중요합니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 베타 아밀로이드 독성을 정밀하게 분석하기 위해 이 sea elgan 시스템을 사용하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 또한 다양한 환경적 요인이나 약물 처리가 이러한 독성에 미치는 매우 미묘한 영향까지 검출할 수 있을 것입니다. 지금까지 설명한 변수들은 매우 중요하므로 주의 깊게 살펴야 하며, 이를 통해 분석의 재현성을 높이고 일관된 마비 역학을 확보할 수 있습니다.

이는 서로 다른 시기에 서로 다른 연구자가 수행한 실험 결과나, 본 모델 시스템을 사용하는 다른 연구자의 결과와 자신의 결과를 비교하고자 할 때 매우 중요합니다.