Culturing and Maintaining Dopaminergic Neurons from Mouse Embryonic Brain Tissue

발달 중인 도파민성 뉴런이 풍부한 배아 중뇌 조직을 트립신-EDTA 용액으로 처리하여 조직 기질에서

소 활성을 억제하기 위해 비활성화 배지를 첨가한 다음 세척하여 잔류 효소를 제거합니다.

조직을 반복적으로 피펫팅합니다. 배아 뉴런은 더 적은 돌출을 가지고 있어 이 교란 동안 스트레스를 줄이고 단일 세포 현탁액을 생성합니다.

원심분리하여 상청액을 제거한 다음 뉴런을 완전한 배지에 재현탁합니다. 세포 부착을 위해 이러한 뉴런을 폴리머 코팅된 커버슬립으로 옮깁니다.

커버슬립을 완전한 배지가 있는 멀티웰 플레이트에 넣어 뉴런 성장에 필수적인 영양분과 성장 인자를 제공합니다.

배지의 항생제는 박테리아 성장을 방지하여 신경 생존력을 지원합니다.

뉴런이 성장하고 성숙함에 따라 축삭 및 수상돌기와 같은 세포 돌출부가 발달하여 시냅스 연결을 형성합니다.

주기적으로 사용된 배지의 절반을 제거하여 독성 부산물을 제거하십시오.

도파민성 뉴런의 장기간 유지를 위해 신선한 배지를 추가합니다.

후드 아래에서 복부 중뇌 컬렉션에서 HBSS를 제거합니다. 그런 다음 조직 12개에 충분한 용액인 따뜻한 0.05% 트립신-EDTA 1밀리리터를 추가합니다. 조직을 섭씨 37도에서 5-10분 동안 배양합니다. 후드 아래에서 트립신-EDTA를 비활성화 배지 1밀리리터로 교체합니다.

혼합물을 부드럽게 휘젓고 비활성화 배지를 제거하되 해리된 세포가 폐기되지 않도록 충분한 배지를 남겨 둡니다. 다음으로, 세포를 잃지 않고 완전 배지로 조직을 두 번 세척합니다. 이제 1밀리리터의 완전 배지를 추가합니다. 그런 다음 단일 세포 현탁액이 얻을 때까지 기포를 형성하지 않고 불로 연마한 피펫으로 조직을 분쇄합니다. 약 8-10번이면 충분합니다.

분쇄 후 400g의 세포를 5분 동안 원심분리합니다. 배지를 제거하고 세포를 1밀리리터의 완전 배지에 재현탁합니다. 현탁액을 얻기 위해 세포를 최대 4회 피펫팅합니다. 혈구측정기를 사용하여 트리판 블루 배제를 사용하여 현탁액에 있는 세포의 상태를 계산하고 평가하는 것으로 시작합니다.

이제 세포 현탁액을 마이크로리터당 1,500개 세포로 조정합니다. 그런 다음 멸균된 미세 원심분리기 튜브 캡을 100mm 접시에 옮깁니다. 집게를 사용하여 준비된 커버슬립을 캡 위에 놓습니다. 커버슬립을 씻지 말고 마르지 않도록 하십시오. 각 커버슬립에 100마이크로리터의 현탁액을 넣습니다.

이 다소 특이한 방법은 90%의 배양 생존 가능성을 제공하며 성공을 위한 중요한 단계입니다. 그런 다음 페트리 접시를 닫고 한 시간 동안 인큐베이터로 옮깁니다. 배양 후, 배지가 있는 커버슬립을 각 웰에서 섭씨 37도까지 예열된 400마이크로리터의 완전 배지를 포함하는 24웰 플레이트로 조심스럽게 옮깁니다. 그런 다음 세포를 밤새 배양합니다.

처음 몇 시간은 세포 생존에 가장 중요합니다. 24시간 이내에 각 웰에 완전 배지 반 밀리리터를 부드럽게 첨가합니다. 2주마다 미디어의 절반을 교체합니다. 배양액이 노랗게 변하면 반배지 교체를 더 빨리 수행할 수 있지만 변경은 여전히 드물어야 합니다. 도파민성 뉴런은 이러한 조건에서 6주 이상 생존합니다.