생산 C. 엘레간스 Transgenes galK 선택 마커

다음 실험의 전반적인 목표는 SMID 라이브러리 클론에 포함된 웜 게놈 DNA를 사용하여 전이유전자를 생성하는 것입니다. 게놈 DNA의 사용은 3개의 주요 UTR 영역에서 인핸서(enhancer)와 같은 모든 네이티브 제어 요소를 보존합니다. 이는 FO smid를 SW 1 0 6 E 대장균 균주로 이동하여 유도 가능한 람다 적색 재조합 기계를 활용함으로써 달성됩니다.

두 번째 단계로, GAL K 유전자를 FO smid의 원하는 위치에 삽입하여 GFP 또는 탭 태그가 배치될 위치를 표시합니다. 다음으로, Gade 유전자는 상동 재조합을 통해 GFP 또는 tap TAC로 대체된 다음, 변형된 전이유전자를 생성하기 위해 deoxy galactose를 사용하여 negative selection을 수행합니다. 이러한 전이유전자가 콜로니 PCR에 의한 T 삽입의 검증을 기반으로 빠르고 성공적으로 생성될 수 있음을 보여주는 결과가 얻어졌습니다.

안녕하세요, 제 이름은 러브 쉽입니다. 저는 피츠버그 대학의 피셔 연구소에서 일하고 있습니다. 오늘은 C의 우아한 형질전환 유전자를 만드는 기술을 시연해 드리겠습니다.

선택 가능한 마커로 GK와 재결합하는 이유. Cogan Transgenes를 생성하는 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 기술에서 관심 유전자의 게놈 DNA를 사용하므로 3개의 프라임 UTR 영역의 제어 요소, 대체 향신료 전사체, 대체 프로모터 및 기존의 표준 클로닝 기반 접근 방식에서 누락될 수 있는 원위 답변과 같은 유전자 조절의 모든 중요한 요소를 포괄할 수 있다는 것입니다. 시작하겠습니다.

Worm Base를 가이드로 사용하여 유전자 서비스에서 관심 유전자 또는 GOI에 대한 FO smid 클론을 주문합니다. 클론을 선택할 때, 우리는 GOI가 염기서열의 중심에 있는 클론을 선택합니다. 인접 유전자를 배제하는 클론이 더 좋을 수 있지만 배양을 찾기가 어려울 수 있습니다.

밀리리터 클로람페니콜 당 12.5마이크로그램을 함유한 LB의 GOI에 대한 SMID 클론인 SMID 클론인 SMID는 EPI 300 균주로 보내지며 섭씨 37도에서 성장할 수 있습니다. 다음으로, 섭씨 37도에서 SMID의 1.5ml 하룻밤 배양을 배양하고 smid DNA를 미니 준비합니다. Epicenter SMID 준비 키트를 사용하여 지침에 설명된 대체 프로토콜을 따르며, 여기에는 Ribo shorter mix를 추가하는 것이 포함됩니다.이전 단계에서 FOSS DNA 농도를 측정합니다.

분광 광도계 필드를 사용하는 것은 일반적으로 매우 낮지만 적절합니다. 성공적인 electroporation를 위해. 14 밀리리터 스냅 캡 튜브에서 섭씨 32도의 LB 배지에서 5 밀리리터 하룻밤 배양을 배양하여 전기 역량 SW 1 0 6 세포를 준비합니다.

다음 날 아침. 배양액 1ml를 2리터 플라스크에 100ml의 lb로 접종합니다. SW 1 0 6 박테리아를 0.6에서 0.8의 OD 600으로 성장시킵니다.

열 충격을 주지 마십시오. 5, 5 분 동안 000 GS에 분리기 분해에 의하여 세포를 펠릿화하십시오. 얼음처럼 차가운 10%글리세롤 1밀리리터에 부드럽게 소용돌이쳐 펠릿을 다시 매달아 놓습니다.

그런 다음 차가운 얼음 50ml, 글리세롤 10%를 추가합니다. 이 세척 단계를 한 번 반복합니다. 마지막으로 SW 1 0 6을 원심 분리로 다시 펠릿하고 DEC는 각 상등액 Resus의 약 500 마이크로 리터를 제외하고는 모두 할 수 없습니다.

부드러운 소용돌이로 펠릿을 매달아 100마이크로리터 알리 와트를 액체 질소 또는 드라이 아이스에 얼리고 변형할 준비가 될 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 1, 350볼트에서 EOR 25 10 전기 퍼터를 사용하여 0.1cm 갭 큐벳에서 약 50나노그램의 fos DNA로 박테리아를 전기 퍼레이딩하여 fosson DNA를 전기 역량 SW 1 0 6 세포로 변환합니다. 섭씨 32도 플레이트에서 1시간 동안 LB 1밀리리터의 박테리아를 회수하고 클로람페니콜이 함유된 LB 플레이트의 Eloqua 플레이트에서 밤새 섭씨 32도에서 배양합니다.

콜로니 PCR을 사용하여 섭씨 32도에서 밀리리터당 12.5마이크로그램의 클로람페니콜로 LB에서 5밀리리터 하룻밤 배양을 배양하여 관심 유전자의 존재를 확인합니다. 다음으로, 배양의 0.5 마이크로 리터에서 측면 올리고와의 표준 PCR 반응으로 늘리고 초기 섭씨 95도 배양을 5 분으로 증가시켜 반응 전에 박테리아를 슬라이스합니다. 마지막으로, 장기 보관을 위해 글리세롤 스톡을 준비하여 관심 유전자를 운반하는 FO smid에 gal K 유전자를 삽입합니다.

먼저 0.2%갈락토스가 포함된 걸레 최소 미디어 플레이트를 준비합니다. 레시피는 이 프로토콜의 서면 부분을 참조하십시오. 다음 PCR은 P mod four gal, k, g 또는 P mod four gal K GT 카세트를 증폭합니다.

우리는 퓨전 또는 go tac 젤을 사용합니다. 생성된 PCR 산물을 정제합니다. 젤에서 또는 NanoDrop 분광 광도계를 사용하여 수율을 정량화합니다.

PCR 산물을 사용할 준비가 될 때까지 섭씨 4도에서 보관하고 5ml의 클로람페니콜을 주입하고 Foss DNA를 포함하는 6개의 세포가 섭씨 32도에서 밤새 자랍니다. 100ml의 lb와 chloramphenicol에 1ml의 하룻밤 배양을 추가하십시오. 2 리터 플라스크에서 0.6에서 0.8의 OD로 성장합니다.

이것은 문화가 성장하는 동안 보통 3-4시간이 걸립니다. 흔들리는 수조를 섭씨 42도로 설정하고 홀더에 있는 멸균 250ml 플라스크로 예열합니다. 다음 단계에서 진탕 수조를 사용하는 것은 높은 효율을 얻는 데 중요합니다.

다음으로 SW 1 0 6 배양 50 밀리리터를 250 밀리리터 플라스크로 옮기고 섭씨 42도 및 100 RPM에서 흔들리는 수조에서 정확히 20 분 동안 열 충격을 가합니다. 나머지 박테리아를 섭씨 32도로 그대로 두어 유도 대조군으로 사용합니다. 유도 박테리아와 비유도 박테리아를 얼음 위에서 10분 동안 식힙니다.

샘플을 두 개의 멸균 원심분리기 튜브로 옮기고 약 5, 000Gs에서 5분 동안 펠릿화합니다. 상등액을 모두 붓고 펠릿을 얼음처럼 차가운 10% 글리세롤 1밀리리터에 부드럽게 와류로 재현탁합니다. 얼음처럼 차가운 49ml, 글리세롤 10%를 더 넣으십시오.

이 세척을 반복한 다음 펠릿을 한 번 더 사용하십시오. 튜브를 반전시켜 상등액을 제거하고 소량의 남아있는 액체 Eloqua에 펠릿을 100 마이크로 리터 샘플로 재현탁시킵니다. 드라이 아이스에 얼려 다음 날 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.

일렉트로 퍼레이드, 유도 및 비유도 SW 1 0 6 셀, 150 나노그램을 갖는 제조된 PCR 생성물을 einor 25 ton electro ratter에서 0.1 센티미터 갭 큐벳을 사용하여 제조하였다. 1, 350볼트로 설정합니다. 14 밀리리터 팔콘 튜브에 1 밀리리터의 LB에서 박테리아를 회수합니다.

배양 후 섭씨 32도에서 4시간 30분 동안 배양하고 13, 200RPM에서 15초 동안 박테리아를 펠릿화하고 M nine 배지에 재현탁합니다. 레시피는 이 프로토콜의 서면 부분을 참조하십시오. 이 세척 단계를 두 번 반복합니다.

풍부한 매체를 제거하려면 걸레에 연속 희석을 도금하기 전에 M nine 1ml에 재현탁하는 것보다 세포를 한 번 더 펠렛화합니다. 최소 배지는 인큐베이터에서 섭씨 32도에서 3-5일 동안 배양합니다. 진정한 양성이 천천히 성장할 때 인내심을 갖고 Macon 한천에 군체를 줄무늬로 만들어 군체를 정화하고 GLK 양성인지 확인하십시오.

군체는 밝은 분홍색으로 변해야 합니다. 단일 콜로니를 선택하고 섭씨 32도에서 5ml lb와 chloramphenicol을 하룻밤 배양합니다. 측면 올리고를 사용하여 PCR을 통해 적절한 위치에 gal 케이지의 삽입을 확인합니다.

이 프로토콜의 서면 부분에 있는 표 1을 참조하십시오. 올리고 염기서열의 경우, 표준 PCR 반응에 배양액 0.5마이크로리터를 추가하고 초기 섭씨 95도 배양을 5분으로 증가시켜 박테리아를 제거합니다. PCR 산물은 GAL K 유전자의 존재로 인해 크기가 상향 이동해야 합니다.

마지막으로 보관을 위해 글리세롤 스톡을 준비합니다. 0.2%데옥시 갈락토오스 또는 DOG와 0.2%글리세롤이 포함된 걸레, 최소 미디어 플레이트를 준비합니다. 레시피는 이 프로토콜의 서면 부분을 참조하십시오. PCR(폴리에틸렌).

첫 번째 라운드에서 사용된 것과 동일한 올리고를 사용하거나 더 짧은 GFP 또는 탭 특정 올리고를 사용하여 PMO 4G FP PBS 1761 또는 PBS 1479의 태그 조각을 증폭합니다. 여러 구조체를 만드는 경우, 동일한 PCR 산물이 모든 구조체 Gel에 사용할 수 있으므로 더 짧은 올리고를 사용하는 것이 특히 유용합니다. PCR 산물을 정제하고 겔 또는 분광 광도계로 농도를 측정하고, 앞서 설명한 바와 같이 Gale K 유전자를 가진 SMID를 운반하는 유도 및 비유도 유능한 W1 0 6 세포를 생성하고, 유도 및 유인 유도 SW 1 0 6 세포를 약 100 나노그램의 PCR 산물로 먹고, EINOR 25 10 10 ator 세트에서 0.1 cm 갭 Q 수의사를 사용하여, 350볼트.

14ml 스냅 캡 튜브에 1ml의 LV를 넣고 32°C의 쉐이커에서 4시간 30분 동안 배양합니다. 앞서 보여진 것처럼 M nine의 세포를 세척하고 희석합니다. 걸레에 박테리아를 플레이트하고 0.2%DOG와 0.2%글리세롤을 포함하는 최소 배지를 섭씨 32도에서 3일 동안 배양하여 삽입의 존재를 확인합니다.

4개의 콜로니를 사용하여 LB에서 5밀리리터 하룻밤 배양액에 밀리리터당 12.5마이크로그램을 접종합니다. 클로람페니콜은 앞서 설명한 대로 콜로니 PCR을 수행합니다. 우리는 더 짧은 GFP 탭 전용 올리고와 측면 올리고를 모두 사용하여 올바른 인서트와 올바른 위치를 보여줍니다.

GFP는 약 800개의 염기쌍입니다. TAP은 약 550 염기쌍이고 gal KT는 1.4입니다. 킬로베이스는 마침내 장기 보관을 위해 글리세롤 스톡을 준비합니다.

재조합을 통한 FO smed의 변형은 강력한 결과를 제공하며 음성 선택 단계에서 90% 이상의 성공률이 일상적으로 관찰됩니다. 또한, 이 프로토콜은 완료하는 데 약 2주가 소요되므로 전이유전자 준비가 상당히 빠르며, DOG 플레이트에서 식별된 48개의 콜로니가 표시되었으며 이 실험에서 GFP 삽입물을 증폭한 GFP Oligos 플래그를 사용하여 콜로니 PCR에 사용되었습니다. 48개 콜로니 중 47개는 정확하고 1개의 콜로니는 올바르게 변형되지 않았으며, DOG 플레이트에서 확인된 48개의 콜로니가 이 실험에서 GFP 삽입물을 증폭한 GFP Oligos 플래그를 사용하여 콜로니 PCR에 사용되었습니다.

48개 콜로니 중 46개가 올바르고 2개 콜로니가 올바르게 수정되지 않았습니다. 이 실험을 수행하는 동안 명심해야 할 가장 중요한 점은 SW 1 0 6 박테리아는 더 높은 온도에서 성장하면 Lambda red 기계를 손상시키는 돌연변이를 가진 돌연변이를 선택하기 때문에 더 높은 온도가 아닌 32°C에서 성장해야 한다는 것입니다. 그러니 실험에 행운을 빕니다.