Name: 免疫印迹检测样品制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-14T17:27:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: 学习免疫印迹检测样品制备的标准流程，包括细胞裂解、蛋白提取、SDS-PAGE电泳分离及转膜等关键步骤。掌握高质量试剂的使用方法，确保蛋白质检测的灵敏度和可靠性，为生物化学研究提供可靠数据。

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1. 样品制备
Western blotting 的第一步是样品制备。为了制备用于跑胶的样品，需要裂解细胞和组织以释放目标蛋白质。
<ul>
	<li>一种方便、即用型且用途广泛、易于使用的可溶性蛋白提取试剂是 CytoBuster 或 PhosphoSafe。这些提取缓冲液含有经优化的去污剂，可高效地从哺乳动物和昆虫细胞中提取可溶性蛋白。CytoBuster 蛋白提取试剂采用温和的非离子型配方，能够分离出具有功能活性的内源性或表达蛋白，无需超声处理或反复冻融等后续步骤。PhosphoSafe 还额外含有四种磷酸酶抑制剂，具有更优性能。
<ol>
	<li>通过低速离心（例如 2500 × g 离心 5 分钟）收集细胞，弃尽上清，充分沥干细胞沉淀。</li>
	<li>用 CytoBuster 蛋白提取试剂重悬细胞，每 106 个细胞使用 150 μL（CytoBuster 蛋白提取试剂的最佳用量可能因细胞大小而异）。</li>
	<li>室温孵育 5 分钟。</li>
	<li>转移至合适离心管中，在 4°C 下以 16,000 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>将澄清的上清液（细胞提取物）转移至新管中，即可进行后续分析。</li>
</ol>
</li>
	<li>对于特定蛋白的提取，我们推荐使用高质量的 ProteoExtract 试剂盒。EMD 提供十余种试剂盒，可用于线粒体分离、亚细胞蛋白质组提取、跨膜蛋白提取等多种应用。更多详情，请访问我们的 Western blot 专题页面。</li>
	<li>EMD 还提供多种蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物试剂盒。细胞裂解一旦发生，蛋白水解、去磷酸化和变性过程即刻开始。若样品始终置于冰上或 4°C 环境中，并在裂解缓冲液中新鲜添加适当的抑制剂，则可显著减缓这些过程。更多详情，请访问我们的 Western blot 专题页面。</li>
</ul>
2. SDS-PAGE
Western印迹的第二步是蛋白质分离。蛋白质根据分子量进行分离。
<ul>
	<li>您可以自行制备PAGE胶，但本实验将使用 commercially pre-cast gel（商用预制胶）。
	<ol>
		<li>在样品制备完成后，即可进行蛋白浓度测定。EMD提供两种用于浓度测定的试剂盒：Non-Interfering Protein Assay Kit 和 BCA Protein Assay Kit。</li>
		<li>在测定蛋白浓度后，即可准备上样。抗体通常识别目标蛋白的一小段区域（称为表位，epitope），而该区域可能位于蛋白的三维构象内部。为了使抗体能够接触到该区域，必须将蛋白展开。</li>
		<li>为实现变性，需使用含有阴离子变性去污剂十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate, SDS）的上样缓冲液，并将混合物在95–100°C下煮沸5分钟。一种简便且常用的上样缓冲液是4X Sample Buffer。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在加样孔的第一道中加入Trail Mix Protein Marker。该蛋白标记物含有三条参考条带，可用于监测电泳进程。染色后可见10条条带，分子量范围为10–225 kDa。</li>
	<li>向电泳装置中加入电泳缓冲液。对于PAGE胶，通常使用1X Tris-glycine缓冲液。如需详细的缓冲液配方，请访问Western blotting页面。EMD通过OmniPur化学试剂系列提供高质量的缓冲液试剂。将凝胶在220 V条件下电泳运行1小时。</li>
	<li>蛋白分离完成后，使用考马斯亮蓝（Coomassie blue）对凝胶染色，以确认蛋白迁移是否均匀一致。RAPIDstain是一种超敏型即用型染色液，无需脱色步骤。</li>
</ul>
3. 蛋白质转印
正如带电荷的蛋白质可以在电场作用下在凝胶中移动一样，这些蛋白质也可以在电场中从凝胶转移至膜上，该膜可以是聚偏二氟乙烯（PVDF）膜或硝酸纤维素（nitrocellulose）膜。
<ul>
	<li>今天我们将进行湿法转膜。在湿法转膜中，凝胶和膜被夹在海绵和滤纸之间（海绵/滤纸/凝胶/膜/滤纸/海绵），确保凝胶与膜之间无气泡后，将整个“三明治”结构紧密夹紧。然后将该结构浸入转移缓冲液中，并施加电场。带负电荷的蛋白质会向带正电荷的电极方向迁移，但会被膜截留并结合，从而阻止其继续移动。</li>
	<li>目前有两种类型的膜可供选择：硝酸纤维素膜（nitrocellulose）和聚偏二氟乙烯膜（PVDF）。两种膜均有良好的转膜效果。今天我们将使用PVDF膜。PVDF膜需先在甲醇中浸泡数分钟，再用冰冻的转移缓冲液浸泡5分钟。凝胶也需在冰冻的转移缓冲液中平衡数分钟。若未进行此步骤，可能导致转膜过程中凝胶收缩。</li>
	<li>湿法转膜所用缓冲液为含20%甲醇的1X Tris-甘氨酸缓冲液。详细的缓冲液配制方法可在我们的网站上查阅。</li>
	<li>转膜完成后，建议对蛋白质进行可视化检测，以确认转膜均匀且无气泡产生。可使用RedAlert Western Blot Stain染色液轻松实现此目的。该染色液为即用型，且可直接用水进行脱色。</li>
</ul>
4. 抗体及辅助试剂
<ul>
	<li>进行探针和抗体与抗原结合的第一步是封闭膜。封闭膜可防止非特异性背景结合。</li>
	<li>可使用脱脂奶粉或牛血清白蛋白（BSA）作为封闭液。然而，在使用磷酸化特异性抗体时，不建议使用奶粉，因为它会导致高背景信号。</li>
	<li>EMD 提供多种高质量的封闭试剂，包括 SeaBlock（一种非哺乳动物来源的封闭剂）和 BLOT QuickBlocker（一种即用型封闭剂）。我们还提供高品质的 BSA（第五组分）。
<ol>
	<li>将膜在室温下轻轻振荡孵育 1 小时。</li>
	<li>孵育后用 TBST 或 PBST 洗涤三次。配制 TBST 或 PBST 的简便方法是使用我们的片剂（PBS TWEEN 片剂 / TBS TWEEN 片剂）。</li>
</ol>
</li>
	<li>膜封闭完成后，即可进行一抗孵育。EMD 三十多年来一直提供种类全面、品质卓越的抗体产品，并拥有业内最佳的抗体保障承诺。请记住，所有 EMD 抗体均享有完整的 100% 无风险保证。购买任意抗体后，您可在任何物种特异性或应用中使用，若抗体未达到您的满意效果，我们将提供全额信用额度，可用于兑换其他任何产品。更多详情，请访问我们的 Western blotting 网页。
 <ol>
		<li>今天我们将使用 SignalBoost 的溶液 1 来孵育一抗。SignalBoost 是一种优异的产品，可显著增强信号强度。只需将一抗加入溶液 1 中，按常规方式孵育 1 小时即可，无需额外添加封闭剂。或者，您也可使用 BSA 或脱脂奶粉作为封闭剂。</li>
		<li>用 TBST 洗涤。我们使用即溶型 TBST 片剂配制 TBST。</li>
		<li>使用 SignalBoost 的溶液 2 孵育二抗。将二抗在封闭缓冲液中孵育 1 小时，然后再次用 TBST 多次洗涤膜。</li>
 </ol>
</li>
</ul>
5. 检测
对于HRP标记的二抗，传统上使用ECL显色。我们提供的一种优质ECL试剂是RapidStep。RapidStep的优点在于无需混合鲁米诺或增强剂，只需将膜喷洒数次，然后使用X光片显影即可。RapidStep具有皮克级的高灵敏度，并且在加入底物后可持续发光长达2小时。

<ol><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R., R, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera%3A+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).</li>
<li>Burnette, W. N. 'W. estern <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((blotting%27%3A+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate+polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).</li>
<li>Ambroz, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+quantification+accuracy+for+Western+blots+Image+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Improving quantification accuracy for Western blots Image Analysis.</a> , (2006).</li>
<li>Quan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species-mediated+endoplasmic+reticulum+stress+and+mitochondrial+dysfunction+contribute+to+cirsimartitin-induced+apoptosis+in+human+gallbladder+carcinoma+GBC-SD+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett+Article%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species-mediated endoplasmic reticulum stress and mitochondrial dysfunction contribute to cirsimartitin-induced apoptosis in human gallbladder carcinoma GBC-SD cells.</a> Cancer Lett Article. , Forthcoming (2010).</li>
<li>O'Malley, D. ervia <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+colonic+corticotrophin-releasing+factor+receptors+in+the+maternally+separated+rat+model+of+irritable+bowel+syndrome%3A+Differential+effects+of+acute+psychological+and+physical+stressors%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Alterations in colonic corticotrophin-releasing factor receptors in the maternally separated rat model of irritable bowel syndrome: Differential effects of acute psychological and physical stressors.</a> Peptides. 31 (4), 662-670 (2010).</li>
</ol>

作者 Anna Eslami 和 Jesse Lujan 受雇于 EMD Chemicals Inc，该公司生产本文所使用的试剂和仪器。

在本视频演示中，我们重点介绍了蛋白质印迹（Western blotting）的主要步骤，包括样品制备、SDS-PAGE、膜的封闭与抗体孵育，以及检测。对于该流程的每一步，都应采用适当的实验方案和合适的试剂，以获得高质量的结果。

<table><tbody><tr><td>CytoBuster&amp;#8482; 蛋白提取试剂</td><td>EMD Millipore</td><td>71009</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/cytobuster&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/cytobuster&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/cytobuster&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/cytobuster&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>PhosphoSafe&amp;#8482; 提取试剂</td><td>EMD Millipore</td><td>71296</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/phosphosafe&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/phosphosafe&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/phosphosafe&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/phosphosafe&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>非干扰性蛋白质测定&amp;#8482; 试剂盒</td><td>EMD Millipore</td><td>488250</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/noninterfering&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/noninterfering&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/noninterfering&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/noninterfering&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>BCA 蛋白检测试剂盒 </td><td>EMD Millipore</td><td>71285</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/BCA&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/BCA&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/BCA&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/BCA&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>4X SDS 样品缓冲液 </td><td>EMD Millipore</td><td>70607</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/4XSDS&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/4XSDS&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/4XSDS&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/4XSDS&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>混合坚果&amp;#8482; 蛋白质分子量标准</td><td>EMD Millipore</td><td>70980</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/trailmix&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/trailmix&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/trailmix&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/trailmix&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>蛋白质&amp;#8211;xtract&amp;#8482; 蛋白质提取试剂盒</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/prote&amp;#8211;xtract&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/prote&amp;#8211;xtract&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/prote&amp;#8211;提取&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/prote&amp;#8211;提取&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>OmniPur&amp;#174; 产品</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/omnipur&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/omnipur&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RAPIDstain&amp;#8482; 试剂</td><td>EMD Millipore</td><td>553215</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/rapidstain&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/rapidstain&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/rapidstain&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/rapidstain&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RedAlert&amp;#8482; 10X 蛋白质印迹染色液</td><td>EMD Millipore</td><td>71078</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/redalert&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/redalert&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/redalert&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/redalert&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>SeaBlock&amp;#8482; 试剂，鲑鱼血浆</td><td>EMD Millipore</td><td>558300</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/seablock&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/seablock&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/seablock&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/seablock&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>BLOT-QuickBlocker 试剂</td><td>EMD Millipore</td><td>WB57</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/quickblocker&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/quickblocker&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/quickblocker&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/quickblocker&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白，第五组分</td><td>EMD Millipore</td><td>12660</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/bovineserum&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/bovineserum&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/bovineserum&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/bovineserum&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>PBS-吐温&amp;#174; 片剂</td><td>EMD Millipore</td><td>524653</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/PBST&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/PBST&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/PBST&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/PBST&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>TBS-吐温&amp;#174; 片剂</td><td>EMD Millipore</td><td>524753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/TBST&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/TBST&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/TBST&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/TBST&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>SignalBoost&amp;#8482; 免疫反应增强试剂盒</td><td>EMD Millipore</td><td>407207</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/signalboost&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/signalboost&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/signalboost&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/signalboost&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RapidStep&amp;#8482; ECL 试剂</td><td>EMD Millipore</td><td>345818</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.emdbiosciences.com/rapidstep&quot;&gt;www.emdbiosciences.com/rapidstep&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.merck4biosciences.com/rapidstep&quot;&gt;www.merck4biosciences.com/rapidstep&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

蛋白质印迹：从样品制备到检测

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

蛋白质印迹（Western blotting）是一种用于检测特定组织匀浆或提取物样品中目标蛋白质的分析技术。该技术利用凝胶电泳，根据多肽链长度（变性条件）或蛋白质的三维结构（非变性条件）来分离天然或变性的蛋白质。随后，将蛋白质转移至膜上（通常为硝酸纤维素膜或PVDF膜），并利用针对目标蛋白的特异性抗体对膜上的蛋白质进行探针检测。

Western blotting 是一种分析技术，用于检测给定组织匀浆或提取物样品中的特定蛋白质。

蛋白质印迹法（Western blotting）是一种用于检测特定组织匀浆或提取物样品中目标蛋白质的分析技术。该技术利用凝胶电泳……

本实验的总体目标是展示使用合适产品进行 Western 印迹的简便性。在完成样品制备后，蛋白质将根据分子大小进行分离，随后转移至固相膜上。然后利用抗体对目标蛋白进行探查，通过采用适当的实验方案以及高质量且经济有效的试剂，可获得更优的 Western 印迹结果。大家好，我是 Jesse Luhan，来自加利福尼亚州圣迭戈的 EMD Chemicals 公司，担任研发科学家。EMD 是德国达姆施塔特市默克集团（Merck KGaA）的附属公司。今天我们将向您展示一种蛋白质印迹（Western blotting）实验流程。那么我们开始吧。蛋白质印迹（Western blotting）的第一步是样品制备。通过低速离心收集细胞，例如在2,500 × g条件下离心5分钟，以进行样品制备的起始步骤。离心后，弃去细胞沉淀。每10^6个细胞加入150 µL细胞裂解蛋白提取试剂，充分重悬细胞。室温孵育5分钟。接下来，在4°C条件下，以16,000 × g离心样品5分钟。将上清液转移至新的离心管中，并继续进行分析。在测定样品的蛋白浓度后，制备样品以加载到凝胶中，使蛋白质变性。使用含有离子型变性去污剂（如十二烷基硫酸钠或SDS）的上样缓冲液。将混合物在95至100摄氏度下煮沸5分钟。利用市售的预制胶，可快速根据分子量分离蛋白质。使用Omni PU化学试剂系列提供的试剂配制电泳运行缓冲液，并将其加入电泳装置中。在加样孔的第一泳道加入混合蛋白预染蛋白标记物。该标记物含有三条参考条带，可用于电泳过程中的监测。染色后，凝胶上可见10条条带，分子量范围为10至225千道尔顿。将变性样品加入剩余的加样孔中，在220伏电压下电泳运行1小时。蛋白分离完成后，使用考马斯亮蓝对凝胶进行染色，以确认蛋白迁移是否均匀一致。可采用即用型快速染色或超敏染色方法，无需进行脱色处理。正如带电荷的蛋白质可在电场作用下穿过凝胶迁移一样，蛋白质也可在电场中从凝胶转移至膜上，例如硝酸纤维素膜（NITROCELLULOSE）或PVDF膜。使用PVDF膜时，需先将其浸入甲醇中数分钟，随后在冰浴的转移缓冲液中平衡5分钟。同时，也将凝胶在冰浴的转移缓冲液中浸泡数分钟。此平衡步骤可防止转移过程中凝胶发生收缩。进行湿转时，将凝胶和膜夹在海绵与滤纸之间形成三明治结构。确保凝胶与膜之间无气泡产生后，用夹子将该结构紧密固定。将此三明治结构浸入转膜缓冲液中，并施加电场。 带负电荷的蛋白质将向带正电荷的电极方向迁移。随后，膜会截留这些蛋白质，与之结合并阻止其继续移动。转膜完成后，对蛋白质进行可视化检测，以确认转膜均匀且无气泡产生。使用红色警戒 Western 印迹染色液即可轻松完成此步骤。该染色液可直接使用，脱色过程只需用水即可轻松完成。此凝胶在转移至膜后，需用水洗涤进行脱色。在用抗体孵育之前，需对膜进行封闭处理。为防止非特异性结合，需使用高质量的封闭试剂对膜进行封闭。将膜在室温下轻轻振荡孵育于封闭液中一小时，以避免背景升高，随后在孵育结束后用 TBST 或 PBST 缓冲液洗涤膜三次。这些缓冲液可分别通过 TBS tween 片剂和 PBS tween 片剂方便地配制而成。封闭并洗涤膜后，可将其与一抗孵育。使用溶液一中的信号增强剂配制一抗，以显著增强信号。将一抗用溶液一稀释后，与膜在室温下孵育1小时。孵育后无需添加其他封闭剂。用TBST洗涤膜，随后将膜与用信号增强液溶液二稀释的二抗在室温下孵育一小时。最后，用 TBST 多次洗涤膜，以用于 HRP 偶联的二抗检测。此处传统上采用增强型化学发光（ECL）进行检测。使用快速步骤的 ECL 试剂，因其无需混合鲁米诺或增强剂。只需将膜喷洒数次，孵育两分钟，然后使用X射线胶片显影。Rapid Step具有低至皮克（picogram）级别的灵敏度，并且在加入底物后长达两小时内仍可产生较弱的发光信号。与标准的Western印迹实验方案相比，Trail mix蛋白标记物可在电泳过程中实现蛋白的追踪。信号增强可实现更宽的动态范围和更高的灵敏度。最后，通过使用 Rapid 步骤替代传统的 ECL 试剂，可以获得更优的灵敏度。我们刚刚向您展示了如何利用一系列全面的产品高效且经济地完成 Western 印迹实验。请记住，实验结果的质量取决于所用试剂的质量。就到这里。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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