وضع علامة سلبية لإختيار a المتحولة الحالة للنسج

الهدف العام من هذه التجربة هو التحقق من صحة استخدام نظام FC FCU الخمسة كطريقة اختيار سلبية في Entera Histolytica في 48 ، بئر ألواح البذور E instolytica ، الخطوط الشفافة التي تعبر عن FCU جين واحد أو التحكم في النواقل المناسبة لمعالجة الخلايا مع المؤيد للدواء خمسة FC في الخلايا التي تعبر عن مستويات عالية من FCU واحد خمسة FC سيتم تحويلها إلى كميات فعالة من المنتجات النهائية السامة. يتم تلطيخ مجموعة الخلايا الباقية ب C-M-F-D-A لإثبات القضاء الانتقائي على الخلايا التعبيرية عن FCU U واحد في وجود خمسة fc وللمقارنة الكمية بين كفاءة الانتقاء السلبي. سيسمح لنا نظام الاختيار السلبي هذا بعلاج البلازميدات العرضية لأول مرة من ضمور TBA النسيجي الحمضي المنقول.

بالنظر إلى التحدي المتمثل في التلاعب الجيني التقليدي ، قد تسمح لنا هذه الطريقة بتعطيل الجينات وحذفها ثم اختبار عوامل VIR المستهدفة في برنامج اكتشاف الأدوية لدينا. يمكن أن تختلف Trophozoites في مدى ازدهار ثقافات المخزون في الثقافة. يمكن أن ينتج عن الخطأ في البداية القطع الأثرية ، وبالتالي فإن الخطوة المبكرة الحاسمة هي مراقبة جودة ثقافة البداية.

قم بزرع خطوط inba hisa قيد الدراسة من أنابيب المخزون في قوارير T 25 وحافظ على الانتقاء عن طريق إضافة مضاد حيوي مناسب في TYIS 33. قوارير احتضان متوسطة عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة حتى تصل الثقافات إلى حوالي 80٪ من التقاء. لهذا الإجراء ، قم دائما بإعداد مخزون جديد سعة 50 مليمولار من خمسة فلور أو FC في TYIS 33 الدافئ.

دوامة متوسطة بصرامة لعدة دقائق لإذابة خمسة FC تماما وتصفية ، وتعقيم محلول المخزون من خلال مرشح 0.22 ميكرون لحصاد التروفوزويت. ضع القوارير على الجليد لمدة ثلاث إلى خمس دقائق واجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 200 ضعف الجاذبية لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الحبيبات في وسط TYI جديد ، وعد الخلايا من أجل تسهيل قياسات الفلورسنت في اتجاه مجرى النهر.

قم بإجراء التجارب في ثلاث نسخ واستخدم صفيحة منفصلة من 48 بئرا لكل سلالة لكل بذرة نقطة زمنية ، 0.5 في 10 إلى الخلايا الأربع لكل بئر بحجم 0.5 مل لكل اختبار. خمسة تركيز FC ، والحفاظ على ضغط اختيار المضادات الحيوية في وسط TII. أضف الآن الكمية المطلوبة من خمسة محلول مخزون FC متبوعا بوسيط TYI إلى الحجم النهائي البالغ ملليلتر واحد لكل بئر واحتضان الألواح في كيس لاهوائي عند 37 درجة مئوية.

قم بإعداد محلول مخزون ملليغرام لكل مليلتر من متتبع الخلية الأخضر C-M-F-D-A في DMSO. ثم لجعل حل العمل ، قم بتخفيف المخزون 1000 مرة في وسط TYI الخالي من المصل في نقاط زمنية تجريبية محددة. قم بإزالة الوسط تماما من ألواح ثقافة Tropho Xite واستبدلها ب 150 ميكرولتر من TYI الخالي من المصل الذي يحتوي على C-M-F-D-A.

استمر في الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، واستنشق محلول DI من الآبار. أخيرا ، اقرأ اللوحة في الأطياف Max M اثنين من مقياس الفلور الطيفي المجهري ، باستخدام طول موجة إثارة يبلغ 492 نانومتر وانبعاث فلوري يبلغ 517 نانومتر. قارن قيم التألق لخلايا التحكم مقابل جهاز الاختبار الشفاف.

استمر في قراءة اللوحات في كل فاصل زمني. استخدم دائما آبار التحكم المناسبة والإيجابية والسلبية في كل لوحة. تظهر تحليلات BLO الغربية التوليد الناجح لترانسفيكت lya الذي يعبر عن FCU واحد ، والخميرة السيتوزين ديأميناز ، واليوراسيل فوسفو ضلع ترانسفيراز الوهم.

تنعكس هذه النتائج أيضا في قياسات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمية. في وجود خمس خلايا تحكم في الفلور تنمو بشكل طبيعي بتركيز يصل إلى خمسة مللي مولار وتصل إلى التقاء بين 72 و 96 ساعة. على النقيض من ذلك ، يتم التخلص من FCU one الذي يعبر عن e خلايا الأنسجة بشكل انتقائي في وجود 0.5 مللي مولار من الدواء الأولي تحت الفحص المجهري الساطع.

تظهر الاستجابة الانتقائية ل FCU التي تعبر عن خلايا E histolitica لعقار FC Pro الخمسة عن طريق تطهير الخلايا. في هذه الحالة ، بعد 72 ساعة من زراعة الترانسفيكت. أثناء محاولة هذه التجربة ، من المهم أن تتذكر مراقبة النمو في كل نقطة زمنية.

يمكن استخدام هذه الطريقة في الطفرات بالضرب والركض ، والتي سنستخدمها للإجابة على أسئلة مهمة حول ضراوة Inba Hisa.