Name: 流式细胞仪定量测定GLUT4转位到质膜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: 学习使用流式细胞仪定量测定GLUT4转位到质膜的方法，该方法通过检测荧光强度来分析胰岛素对肌母细胞中GLUT4定位的影响，可用于研究葡萄糖代谢及代谢性疾病。

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本研究工作获得了Clifford Elder White Graham冠名研究基金和美国国立卫生研究院（NIH，项目号AR059838）对CB的资助，美国国立卫生研究院（NIH，项目号AR052791、AR044387-ARRA和NS063298）对LTT的资助，以及贝勒医学院细胞计量与细胞分选核心设施的资助，该核心设施由美国国立卫生研究院（NCRR S10RR024574、NIAID AI036211和NCI P30CA125123）提供经费支持。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

1. 细胞染色
<ol>
<li>准备细胞。应使用处于活跃生长状态的细胞（60–80% 汇合度）。将细胞在无血清培养基中饥饿过夜，以每孔0.1百万的密度接种于24孔板中，每孔加入0.5 mL无血清培养基，放入培养箱（37°C，5% CO2）中孵育30分钟至2小时，使细胞从胰蛋白酶消化中恢复。</li>
<li>混合一抗和二抗。按（每5 μL抗GLUT4一抗与1 μL AlexaFluor 488标记的鸡抗山羊IgG二抗）的比例配制混合抗体溶液，总量根据孔数计算。室温避光孵育10分钟。</li>
<li>用培养基稀释胰岛素，配制2倍工作浓度的胰岛素溶液。</li>
<li>检查细胞是否已贴壁。</li>
<li>向含细胞的孔中轻柔加入6 μL抗体混合液和0.5 mL 2倍工作浓度的胰岛素溶液。避免培养基产生湍流。在37°C、5% CO2条件下避光孵育30分钟。</li>
<li>向每孔加入0.5 mL PBS + 1% PFA固定细胞，过程中不晃动细胞。室温避光孵育20分钟。</li>
<li>若细胞已贴壁，用细胞刮轻轻刮下细胞。将细胞悬液（总体积1 mL）转移至适用于流式细胞仪的离心管中，离心以收集细胞沉淀。</li>
<li>用1 mL PBS洗涤细胞沉淀两次，最后将细胞重悬于0.4 mL PBS + 1% PFA中。此时，细胞可用铝箔包裹后置于冰箱（4–8°C）保存，或直接送至流式细胞仪进行数据采集。</li>
</ol>
2. 数据采集
<ol>
<li>在侧向散射光（SSC）与前向散射光（FCS）图中，对活细胞设置较宽的门控。使用阴性对照管（未用胰岛素处理的细胞或使用同型对照抗体“染色”的细胞）来设定FL1参数。确保峰完全位于图内，不被截断在低端。</li>
<li>每管至少采集10,000个细胞的数据。</li>
</ol>
3. 数据分析
<ol>
<li>在SSC与FSC图中圈选活细胞门控区域（图1A）。绘制门控内活细胞的AlexaFluor 488荧光强度相对于细胞数量的直方图（图1B）。可叠加不同直方图以直观比较差异，但进行定量分析时，应确定每个细胞群体的平均荧光强度和中位荧光强度，并使用这些数值进行比较（图1C）。</li>
<li>将数据归一化至无胰岛素处理组所得值，如图1C和1D所示。</li>
</ol>
4. 典型结果
从健康个体（无胰岛素抵抗）分离的成肌细胞中，胰岛素可诱导 GLUT4 以剂量依赖的方式从细胞质转位至细胞膜（图1，左）。相反，在从胰岛素抵抗患者分离的成肌细胞中，胰岛素不能诱导 GLUT4 向细胞膜的转位（图1，右）。
<img src="/files/ftp_upload/2429/2429fig1.jpg" alt="胰岛素抵抗的流式细胞术分析；散点图、直方图和MFI柱状图用于分析细胞。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 染色实验示例。成肌细胞分别来自无胰岛素抵抗的供体（左）和患有胰岛素抵抗的患者（右）。A，SSC（侧向散射）对FSC（前向散射）散点图，并对活细胞设门。B，在A图设门的细胞，使用针对GLUT4外在表位的抗体进行染色，未受刺激（红色）或经1 nM（蓝色）、10 nM（橙色）或100 nM（绿色）胰岛素刺激。为清晰起见，图中仅显示胰岛素抵抗细胞在无胰岛素和100 nM胰岛素刺激下的数据。C，B图中直方图的平均荧光强度（MFI）被归一化至未受刺激（无胰岛素）细胞的MFI值。D，B图中直方图归一化MFI数据的曲线图。

<ol><li>Zhao, F. Q., Keating, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+and+genomics+of+glucose+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Functional properties and genomics of glucose transporters.</a> Curr. Genomics. 8, 113-128 (2007).</li>
<li>Karnieli, E., Armoni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+the+insulin-responsive+glucose+transporter+GLUT4+gene%3A+from+physiology+to+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of the insulin-responsive glucose transporter GLUT4 gene: from physiology to pathology.</a> Am. J. Endocrinol. Metab. 295, 38-45 (2008).</li>
<li>Graham, T. E., Kahn, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+alterations+of+glucose+transport+and+molecular+mechanisms+of+intertissue+communication+in+obesity+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Horm.+Metab.+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific alterations of glucose transport and molecular mechanisms of intertissue communication in obesity and type 2 diabetes.</a> Horm. Metab. Res. 39, 717-721 (2007).</li>
<li>Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD107a+as+a+functional+marker+for+the+identification+of+natural+killer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity.</a> J. Immunol. Methods. 294, 15-22 (2004).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutellingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labeled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V.</a> J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).</li>
<li>Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+analysis+in+flow+cytometry%3A+the+future+just+started%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Data analysis in flow cytometry: the future just started.</a> Cytometry A. 77, 705-713 (2010).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

我们已展示了一种通过流式细胞术快速定量GLUT4从细胞质向细胞膜转位的技术。
GLUT4 仅在细胞质膜上瞬时表达，并会被内吞。由于结合的抗体即使在内吞过程中仍与 GLUT4 保持结合，因此荧光信号反映了在胰岛素存在下选定孵育时间内暴露于质膜的 GLUT4 总量。
只要存在针对目标蛋白的胞外表位的优质抗体，该技术也可用于研究其他蛋白从细胞内区室向质膜的转位。例如，目前常用一种类似的检测方法，通过检测CD107a向细胞质膜的转位来评估细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤淋巴细胞的脱颗粒速率4,5。在细胞凋亡或坏死过程中，磷脂酰丝氨酸从质膜内侧向外侧的转位也可通过流式细胞术检测，使用荧光标记的Annexin V即可实现6。
除了检测速度快之外，流式细胞术还具有能够研究混合细胞群体中蛋白质向质膜转位的优势。实际上，可以同时对细胞亚群标志物和目标蛋白进行染色，随后在多激光流式细胞仪上获取数据7。
方案第1.2段中提供的抗体用量仅为起始参考值；我们建议您使用目标细胞对抗体进行滴定，以确定能够产生最大信号的最低抗体浓度。本实验所用的抗人GLUT4一抗的合适起始用量范围为每管1-10 μL（即每管0.2-2 μg抗体），每管所含细胞数不超过100万个。对于其他一抗，请参考供应商提供的说明书。
由于不同供体之间以及不同实验之间的细胞自发荧光存在差异，因此有必要对数据进行标准化处理。

<table><tbody><tr><td>抗人 GLUT4 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-1606</td><td>针对 GLUT4 的外部表位</td></tr><tr><td>与 AlexaFluor 488 偶联的鸡抗山羊 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-21467</td><td></td></tr><tr><td>重组人胰岛素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>VWR international</td><td>29942-118</td><td>裁剪以适配孔板</td></tr><tr><td>用于 FACS 的 5 ml 管</td><td>VWR international</td><td>60819-138</td><td>适配所有 BD 仪器</td></tr></tbody></table>

通过流式细胞术对glut4向质膜转位进行定量测量

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

葡萄糖是身体的主要能量来源，需要持续调节其血液浓度。胰腺释放的胰岛素可促进胰岛素敏感组织（尤其是大脑、骨骼肌和脂肪细胞）对葡萄糖的摄取。患有2型糖尿病和/或肥胖症的患者常出现胰岛素抵抗，无法有效控制其葡萄糖稳态。深入理解胰岛素抵抗的机制可能为2型糖尿病提供新的治疗策略。
葡萄糖转运蛋白GLUT家族包含十三个成员，分布于全身不同组织中1。葡萄糖转运蛋白4型（GLUT4）是介导胰岛素敏感组织（如骨骼肌）摄取葡萄糖的主要转运蛋白。当胰岛素与其受体结合后，含有GLUT4的囊泡从细胞质转位至质膜，从而促进葡萄糖的摄取。GLUT4转位减少是2型糖尿病胰岛素抵抗的原因之一2,3。
通过免疫细胞化学方法，使用与荧光染料偶联的GLUT4特异性抗体，可以观察到GLUT4从细胞质向质膜的转位。
本文介绍了一种利用流式细胞术定量检测在选定时间内细胞中GLUT4向质膜转位总量的技术。该方案快速高效（包括胰岛素孵育在内少于4小时），单次实验每种条件下可分析少至3,000个、多至100万个细胞。该方法依赖于靶向GLUT4转运蛋白胞外表位的特异性抗体，当GLUT4在转位至质膜后暴露于细胞外环境时，抗体即可立即与其结合。

本方案描述了一种通过流式细胞术快速定量GLUT4从细胞质向细胞膜转位的技术。

通过流式细胞术对GLUT4向质膜转位进行定量测量

葡萄糖是机体的主要能量来源，需要对其血液浓度进行持续调节。胰腺释放的胰岛素可诱导……

本实验的总体目标是检测胰岛素刺激下 GLUT4 向哺乳动物细胞质膜的转位。首先将血清饥饿的成肌细胞接种于 24 孔培养板中，这些细胞内的 GLUT4 蛋白仅存在于胞内囊泡中；随后加入针对 GLUT4 外部表位的抗体，该抗体事先已与荧光标记的二抗进行预孵育，接着再加入胰岛素。细胞表面的胰岛素受体被激活后，会引发葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）向质膜表面转位。随后，培养基中的抗体可识别GLUT4。此时，可对细胞进行固定，并通过流式细胞术检测荧光染色的强度。该方法可用于研究 GGL4 转位和葡萄糖代谢，也可应用于其他系统，例如通过细胞膜表面 CD107a 的暴露来检测 NK 细胞脱颗粒。进行此操作时，应使用处于活跃生长期或汇合度为 60% 至 80% 的细胞，并在实验前经血清饥饿处理过夜。用胰酶消化收集细胞后，用常规培养基洗涤并重悬细胞，浓度为每毫升 200,000 个细胞，在 24 孔板中每孔加入 500 微升，每孔接种 10 万个细胞。随后将细胞在 37°C 下孵育 1 小时，以使细胞从胰酶消化中恢复。在此期间，将抗谷胶蛋白四抗体与 Alexa Fluor 488 标记的二抗（鸡抗小鼠 IgG）按 5:1 的比例混合，计算所需终体积，注意每个样本孔将使用 10 微升抗体混合液。将抗体混合液于室温避光孵育 10 分钟。在抗体混合液孵育的同时，用生长培养基将胰岛素稀释至所需浓度，配制为 2 倍工作浓度的储备液。细胞孵育一小时后，将其从培养箱中取出。向每孔细胞中轻柔加入10 µL抗体溶液。注意至少保留一个孔不进行染色。此阴性样本将用于后续流式细胞仪的设置。接下来，向每个孔中加入500微升的两倍胰岛素储备液，以诱导GLUT4向细胞表面转位，并将培养板在37°C避光条件下孵育30分钟。从培养箱中取出细胞后，通过向每孔加入1毫升含1%多聚甲醛的PBS溶液固定细胞，并在室温避光条件下孵育20分钟。使用细胞刮轻轻将固定的细胞从孔底刮下，并将每孔中的细胞分别转移至对应的流式管中。离心试管以沉淀细胞，然后涡旋并用一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞进行洗涤，再次离心。重复洗涤一次，共洗涤两次，每次洗涤之间弃去上清液。最后，将洗涤后的细胞重悬于400微升含1%多聚甲醛的PBS中。此时，细胞可用于流式细胞仪检测GLUT4的表面表达水平。将样本送至流式细胞仪后，首先采集未染色对照样本的数据。使用前向散射和侧向散射参数定义一个宽泛的活细胞门控。然后调整FL1通道的电压设置，使阴性峰位于直方图的显示范围内。参数设定完成后，对每个实验样本进行检测，每管至少记录10,000个活细胞事件。该直方图显示了暴露于 0、1、10 或 100 纳摩尔胰岛素的成肌细胞表面 Glu4 染色的上调情况。相比之下，来自胰岛素抵抗个体的成肌细胞在 100 纳摩尔胰岛素刺激下未能上调 Glu4。如果将刺激细胞的平均荧光强度归一化至未刺激细胞的荧光强度，则可直接比较健康个体与胰岛素抵抗个体成肌细胞的 MFI 值。通过此方法，可对混合细胞群体中的细胞进行额外的表面或胞内标志物染色，以鉴定不同的细胞亚群。

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流式细胞仪定量测定GLUT4转位到质膜

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