Hyperinsulinämische-euglykämische Clamp in der Conscious Rat

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Insulinsensitivität bei wachen, unbewegten Ratten zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst die linke Arteria carotis katheterisiert wird. Anschließend wird die rechte Vena jugularis katheterisiert, um optimale Ergebnisse sicherzustellen.

Die Katheter werden täglich gespült, um während einer fünftägigen postoperativen Erholungsphase die Durchgängigkeit zu erhalten. Letztendlich können Ergebnisse aus dem hyperinsulinämischen euglykämischen Clamp erhalten werden, die die Glukoseinfusionsraten des gesamten Körpers zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass direkte Messungen der Glukoseverwertungsraten des gesamten Körpers bei hohen physiologischen Insulinspiegeln erhalten werden können.

Arterielle und venöse Katheter müssen vor dem chirurgischen Eingriff vorbereitet werden. Der Katheter sollte stumpfe Enden aufweisen, mit heparinisiertem Kochsalzlösung gefüllt sein und mit Ethanol sterilisiert werden, wobei ein Haltebügel sicher 2,7 bzw. 3,2 Zentimeter von einem Ende entfernt befestigt ist, und zwar für arterielle bzw. venöse Katheter. Bei diesem Verfahren werden erwachsene männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von etwa 300 Gramm verwendet.

Notieren Sie das Startgewicht des Tieres und verwenden Sie dieses Gewicht, um die Gewichtszunahme nach der Operation zu überwachen. Arbeiten Sie in einem aseptischen Operationsbereich. Betäuben Sie die Ratte mit 3 % Isofluran, indem Sie sie in eine Narkosekammer stellen.

Bringen Sie das Tier vom Operationsbereich weg und bereiten Sie die Inzisionsstelle vor, indem Sie das Fell um den Hals und die Schultern entfernen. Sobald das Fell entfernt ist, platzieren Sie das Tier in eine Nasenkonusvorrichtung, um die Anästhesie mit etwa 2 % Isofluran aufrechtzuerhalten. Sichern Sie das Tier am Operationstisch fest.

Stellen Sie sicher, dass die Ratte vollständig anästhesiert ist, indem Sie das Vorhandensein von Fuß- und/oder Augenreflexen überprüfen. Reinigen Sie die Inzisionsstelle mit 70 % Ethanol, gefolgt von einer Betadine-Schrubbung und erneut mit 70 % Ethanol. Der erste Schritt des Verfahrens besteht darin, einen kleinen vertikalen medianen Schnitt 10 Millimeter oberhalb des Sternums anzulegen.

Verwenden Sie gebogene mikrochirurgische Pinzetten, um das Gewebe stumpf zu dissezieren und den linken sternokleidomastoideus Muskel freizulegen. Klappen Sie diesen Muskel zurück, um etwa einen Zentimeter der linken Arteria carotis zu exponieren. Legen Sie die mikrochirurgische Pinzette unter die Arteria carotis, um sie festzuhalten, während das Bindegewebe vorsichtig abgelöst wird.

Es ist wichtig, den Vagusnerv schonend von der Arterie zu isolieren, ohne die Arterie oder den Nerv zu beschädigen. Verwenden Sie sterile 4-0-Seidennaht, um das zephalad gelegene Ende zu ligieren. Klemmen Sie das Gefäß mit gezackten mikrochirurgischen Dissektionspinzetten ab.

Stechen Sie die ligiert. Beenden Sie mit einem 21-Gauge-Ven-Entnahmeführungssystem für Mehrfachproben. Entfernen Sie den Edelstahlstopfen von dem Katheter und führen Sie den Katheter mit einem sterilen Kathetereinführer in die Arterie ein.

Verwenden Sie eine Pinzette, um sicherzustellen, dass der Katheter sicher sitzt. Lösen Sie die mikrochirurgische Pinzette teilweise, klemmen Sie die Arterie ab und fahren Sie fort, den Katheter bis zur Perle einzuführen. Zu diesem Zeitpunkt sollte sich die Katheterspitze im Aortenbogen befinden.

Fixieren Sie zwei Nähte unterhalb der Perle und eine oberhalb, und spülen Sie die Leitung mit heparinisiertem Salin (10 Einheiten pro Milliliter) durch. Um zu bestätigen, dass der Katheter funktionstüchtig ist, verstopfen Sie das äußere Ende des Katheters mit einem Edelstahlstopfen. Danach stumpf das Gewebe dissezieren, um die rechte äußere Jugularvene freizulegen, die Vene vorsichtig isolieren und die Vena cephalica ligieren.

Beenden Sie mit Seidenlitze. Durchstechen Sie die Vene mit einer 21-Gauge-Nadel. Stossen Sie den Multis-Proben-Lure-Adapter aus.

Entfernen Sie den Edelstahlstopfen aus dem Katheter und verwenden Sie einen sterilen Katheter-Einführer, um ihn bis zur Kugel einzuführen. Sichern Sie zwei Nähte unterhalb der Kugel und eine oberhalb. Spülen Sie die Leitung anschließend mit Heparin-Eis-Salzlösung (10 Einheiten pro Milliliter) durch.

Um zu bestätigen, dass der Katheter probeentnehmen kann, stecken Sie das äußere Ende des Katheters mit einem Edelstahlstopfen zu und führen Sie eine stumpfe Nadel der Größe 14 unter die Haut ein. Führen Sie einen Schnitt im Rücken zwischen den Schulterblättern durch. Danach führen Sie die Katheter durch die Nadel, sodass sie aus dem Rücken der Ratte austreten. Etwa vier Zentimeter jedes Katheters sollten sichtbar sein.

Schneiden Sie 0,5 Zentimeter medizinischen Schlauch Tigon S 50 HL ab und platzieren Sie ihn über beide externen Katheter. Sichern Sie mit blauem Klebeband für Venen und rotem für Arterien. Überprüfen Sie die Katheter erneut auf Durchgängigkeit und spülen und füllen Sie sie anschließend mit 150 Einheiten pro Milliliter heparinisiertem Kochsalzlösung, um eine Gerinnung zu verhindern.

Schließen Sie alle Inzisionen mit einer 3-0-Seidennaht. Legen Sie die Ratte in Bauchlage in einen vorgewärmten, sauberen Käfig mit leicht zugänglichem Futter. Sobald die Ratte die volle Bewegungsfähigkeit und Wachheit zurückgewonnen hat, bringen Sie sie in den Heimkäfig zurück.

Lassen Sie die Ratte drei bis fünf Tage unter täglicher Überwachung auf Infektionen, Schmerzen und Gewichtsveränderungen genesen. Es ist wichtig, dass die Katheterpatenz während der gesamten Studie erhalten bleibt. Füllen Sie jeden Tag nach der Operation Ein-Milliliter-Spritzen mit stumpfem Ende mit heparinisiertem Salin (150 Einheiten pro Milliliter) und verschließen Sie sie mit einer 22-Gauge-Blindnadel.

Die stumpfe Nadel wird in 20 Zentimeter PE 50-Schlauch eingeführt, der am anderen Ende mit einem 23-Gauge-Edelstahl-Schlauchverbinder ausgestattet ist. Achten Sie darauf, alle Luftblasen aus der Leitung zu entfernen. Klemmen Sie die von der Ratte nach außen geführte arterielle Leitung mit einer Hämmerklemme ab, und zwar direkt unterhalb des Verschlusses.

Entfernen Sie den Stahlkatheterstopfen mit einem weiteren Paar Hämostaten. Führen Sie die mit der Spritze verbundene Schlauchkupplung in die arterielle Leitung ein und lösen Sie die die außen liegende arterielle Katheterleitung okkludierenden Hämostaten. Anschließend aspirieren Sie das arterielle Blut aus dem Katheter in die Spritze.

Wenn der Katheter nicht leicht absaugt, kann es notwendig sein, eine kleine Menge Lösung sehr vorsichtig durch den Katheter zu injizieren, um die Spitze zu lösen. Der Katheter gilt als freigegeben. Sobald Blut die Spritze erreicht, verschließen Sie den P 50-Schlauch nahe der Ein-Milliliter-Spritze und entsorgen Sie die Spritze.

Ersetzen Sie die Spritze durch eine neue, die mit frischer, mit Heparin versetzter Eis-Salzlösung gefüllt ist. Öffnen Sie die Klemme der Schlauchleitung und klopfen Sie dabei, die neue Spritze aufrecht haltend, leicht gegen die Spritze, um Luftblasen nach oben und weg von der Leitung zu bewegen. Injizieren Sie die heparinisierte Salzlösung, bis die Katheterleitung frei von Blut und klar ist.

Klemmen Sie die arterielle Leitung direkt unterhalb des Schlauchkupplungsstücks ab. Entfernen Sie den Spritzenanschluss von der arteriellen Katheterleitung und ersetzen Sie ihn durch den Edelstahlrohrstopfen. Öffnen Sie die den externen arteriellen Katheter verschließenden Hämostaten.

Wiederholen Sie dieses Verfahren für die venöse Leitung. Aufgrund des niedrigen venösen Drucks ist eine Probenentnahme möglicherweise nicht möglich. Im Allgemeinen lässt sich, wenn die heparinisierte Kochsalzlösung mit minimalem Widerstand infundiert werden kann, davon ausgehen, dass sich der Katheter gut in der Vene positioniert befindet.

Bevor mit dem Verfahren begonnen wird, müssen die Tiere gewogen, die Lösungen vorbereitet und die Klemmvorrichtung zusammengestellt werden. Nachdem das Tier gewogen und die Katheterpatenz bestätigt wurde, stellen Sie es in einen kleinen Behälter mit Einstreu, der die Bewegung einschränkt, aber nicht verhindert. Die in dieser Studie verwendeten Ratten werden mindestens fünf Stunden lang nüchtern gehalten und erfüllen die Anforderungen an das postoperative Gewichtszunahme. Das Gewicht der Ratte bestimmt hier die erforderliche Menge an Insulin.

Es werden vier Milli-Einheiten pro Kilogramm pro Minute mit einer Rate von zwei Mikrolitern pro Minute verabreicht. Bereiten Sie eine 50%ige Dextroselösung vor und stellen Sie sicher, dass von beiden Lösungen jeweils ausreichend für etwa zwei Stunden vorhanden ist; hier werden Dreimilliliter-Spritzen verwendet. Nun sind Sie bereit, die Klemmapparatur zusammenzubauen.

Richten Sie die Leitungen und Infusionspumpen wie hier gezeigt ein. Befestigen Sie die Glukose- und Insulinspritzen an der Spritzenpumpe. Klemmen Sie die Leitungen ab und lassen Sie die Ratte vor Beginn des Experiments 30 Minuten lang entspannen.

Um das Verfahren zu beginnen, entnehmen Sie eine Basisinsulin- und Hämatokritprobe; die Hämatokritbestimmung stellt sicher, dass das Blutvolumen während des gesamten Experiments aufrechterhalten wird. Im Allgemeinen sollte der Hämatokritwert nicht um mehr als 10 % des Ausgangswerts abfallen. Entnehmen Sie eine Basisglukoseprobe und bestimmen Sie den zu clampenden Glukosespiegel.

Hier klemmen wir bei U-Glykämie oder fünf Millimolar. Nach jeder Blutprobe spülen Sie die arterielle Leitung mit einem kleinen Volumen an Heparinlösung (10 Einheiten pro Milliliter) durch, um eine Gerinnung zu verhindern. Nachdem der zu klemmende Glukosespiegel bestimmt wurde, beginnen Sie die Infusion der Insulinlösung.

Notieren Sie den Blutzuckerspiegel in Abständen von fünf bis zehn Minuten und passen Sie die Glukoseinfusionsrate entsprechend an, bis ein stationärer Zustand erreicht ist. Dieser Prozess erfolgt im Allgemeinen nach dem Prinzip von Versuch und Irrtum und kann zwischen 30 Minuten und mehr als zwei Stunden dauern. Die Menge an Glukose, die zur Aufrechterhaltung der Glykämie erforderlich ist, hängt vom experimentellen Protokoll ab.

Um als geregelt betrachtet zu werden, müssen drei aufeinanderfolgende Messungen innerhalb eines definierten Bereichs liegen. Drei Messwerte, die etwa ein Millimolar voneinander abweichen, deuten darauf hin, dass die Glukosespiegel einen stabilen Zustand erreicht haben. Die Glukoseinfusionsrate, die erforderlich ist, um die Glykämie über einen Zeitraum von 30 Minuten aufrechtzuerhalten, kann während dieses Zeitraums zusätzlich mit minimalen Blutproben ermittelt werden.

Es sollte eine zweite Probe für die Bestimmung des Plasmainsulin-Hämatokrits gesammelt werden, sobald das Clamp-Verfahren abgeschlossen ist. Die Tiere können für weitere Untersuchungen verwendet oder euthanasiert werden, wobei Gewebe für weitere Analysen entnommen wird. Abhängig vom Tier können die Katheterleitungen bei korrekter Durchführung fünf bis sieben Tage lang durchgängig bleiben.

Das Klemmverfahren kann die Insulinempfindlichkeit im stationären Zustand messen. Es ist entscheidend, die Konzentrationen von Insulin und Glukose sowie die Glukoseinfusionsraten und die Hämatokritwerte zu erfassen. Der stationäre Zustand ist erreicht, wenn die Glukosewerte über einen Zeitraum von 30 Minuten hinweg innerhalb eines Millimolars zueinander liegen.

Die Glukoseinfusionsrate zeigt das Ausmaß an exogener Glukose an, das erforderlich ist, um die Blutglukosekonzentration auf einem konstanten Niveau zu halten, wobei der Verlauf der Rate über die Zeit erfasst werden sollte, anstatt nur einen einzelnen Durchschnittswert zu einem bestimmten Zeitpunkt zu betrachten. Sowohl die Insulinkonzentrationen im nüchternen Zustand als auch unter Clamp-Bedingungen sollten angegeben werden. Diese Messgrößen bestätigen, dass Insulin erfolgreich verabreicht wurde, und ermöglichen den Nachweis von Unterschieden in der Insulinantwort zwischen den Behandlungsgruppen. Die Bestimmung der Hämatokritwerte zu Beginn sowie erneut nach dem Eingriff stellt sicher, dass die Werte im Verlauf des Experiments nicht um mehr als 5 % gegenüber dem Ausgangswert abgenommen haben. Dieses Vorgehen ist anschließend durchzuführen.

Andere Methoden wie die Verabreichung von Isotopenmarkern können verwendet werden, um die Ganzkörper- und gewebespezifische Glukoseverwertung zu bewerten.