C. elegans Positive Butanone Learning, kurzfristige und langfristige Assoziative Speicher Assays

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, das Kurz- und Langzeitgedächtnis einer erlernten positiven Assoziation zwischen Nahrung und der Chemo zu testen. Lockstoff Butan nach dem Vorbild C Elegance. Dies wird erreicht, indem junge erwachsene Würmer zunächst eine Stunde lang ausgehungert, synchronisiert und gut genährt werden.

Als nächstes werden die Würmer in Gegenwart von Nahrung und Butan trainiert, die durch Mastkonditionierung für das assoziative Kurzzeitgedächtnis und durch räumliche Konditionierung für das assoziative Langzeitgedächtnis bekannt sind. Nach der Konditionierung wird die Chemotaxis in Richtung Butan known gemessen und mit der naiven Chemotaxis verglichen. Zur Untersuchung der Gedächtniserhaltung werden Ergebnisse erhalten, die die Dauer des kurz- und langfristigen assoziativen Gedächtnisses des gelernten Lebensmittels Butan auf der Grundlage von Veränderungen im Lernindex zeigen.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich des kognitiven Alterns und der Krankheit zu beantworten, z. B. welche genetischen Signalwege für die neuronale Funktion im normalen Altern und bei neurodegenerativen Krankheitszuständen erforderlich sind und wie Lernen und Gedächtnis verbessert werden können. Unter den Bedingungen einer kognitiven Beeinträchtigung werden Würmer mit Standardmethoden auf 100 Millimeter hohen Wachstumsmedienplatten präpariert, die mit einem Milliliter OP 50 e coli besetzt sind. Verwenden Sie junge Erwachsene mit einer Dichte von etwa 5.000 Würmern oder weniger pro Platte.

Sammeln Sie die Würmer, indem Sie M neun Puffer vorsichtig auf die Platte gießen und die Würmer frei schwenken. Versuchen Sie, Unruhe zu minimieren, die unerwünschte Bakterien verdrängen kann. Kippen Sie dann die Platte und ziehen Sie die Pufferwurmmischung aus der Ecke nach oben.

Mit einem P 1000 Rohr Pepin. Übertragen Sie die Würmer in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Achten Sie darauf, die Würmer nicht gegen die Seite zu spritzen, wenn Würmer auf der Platte verbleiben.

Wiederholen Sie diesen Schritt ein- bis zweimal. Lassen Sie die Würmer sich durch die Schwerkraft am Boden des Rohrs absetzen. Eine Zentrifugation wird für beste Ergebnisse nicht empfohlen.

Nach dem Absetzen wird das Supinat durch Vakuumieren entfernt und mit mindestens drei bis vier Millilitern M neun Puffer gewaschen. Schnelles Arbeiten, um Hunger zu verhindern. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal für insgesamt drei Wäschen.

Zu diesem Zeitpunkt kann eine Kohorte von Würmern beiseite gelegt werden, die als naive Gruppe in den Chemotaxis-Assays dient, die später demonstriert werden, um Würmer für das Training vorzubereiten, drei bis vier Milliliter M neun Puffer in das Röhrchen zu geben und die Würmer eine Stunde lang bei Raumtemperatur hungern zu lassen, die Konditionierungsplatten vorzubereiten, indem zwei Mikroliter 10%iges Butan in 95%iges Ethanol auf die Innenseite der Deckel gestreift werden von 60 Millimeter NGM-Platten, die mit 500 Mikrolitern OP 50 e coli besiedelt wurden. Entfernen Sie das Supinat aus der Tube der ausgehungerten Würmer und verwenden Sie ein P 1000 Rohr Pepin, um 100 bis 200 Mikroliter Würmer auf jede Konditionierungsplatte zu übertragen. Konditionierungsplatten nach der Konditionierung eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren.

Die Würmer mit etwa einem Milliliter M neun Puffer von den Platten waschen und in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen umfüllen. Wiederholen Sie die zuvor beschriebenen schonenden Waschmethoden, bis der Puffer frei erscheint. Nach dem Waschen kann eine Untergruppe von Würmern entfernt und im Chemotaxis-Assay getestet werden, um als Zeit-Null-Gruppe für einmaliges assoziatives Lernen zu dienen, um Platten einzurichten, die zusätzliche Zeitpunkte darstellen.

Übertragen Sie 100 bis 200 Mikroliter Würmer auf ausgesäte 60-Millimeter-NGM-Platten. Inkubieren Sie diese Platten nach der Konditionierung 0,51 oder zwei Stunden lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie nach jedem Zeitpunkt vorsichtig Würmer von den Platten in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und ein- bis zweimal mehr.

Mit M neun Puffer nach dem gleichen schonenden Waschverfahren wird das assoziative Kurzzeitgedächtnis mit dem Chemotaxis-Assay getestet, der später demonstriert wird. Bereiten Sie die Konditionierungsplatten und Würmer wie für das kurzfristige Training vorgeführt vor, aber lassen Sie die Würmer nur 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Sammeln Sie die Würmer nach der Inkubation wie zuvor gezeigt.

Übertragen Sie sie auf UNSEEDED 60 Millimeter NGM-Platten. Die Würmer für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf die aussaatmatten legen. Nachdem die Würmer ausgehungert sind, die Würmer mit M neun Puffer waschen und wieder in das 15 Milliliter konische Röhrchen geben. Wiederhole diese Schritte, bis insgesamt sieben Konditionierungsblöcke und sechs Hungerblöcke abgeschlossen sind.

Wenn die Konditionierung abgeschlossen ist, waschen Sie die Würmer von den Konditionierungsplatten zurück in ein konisches Rohr. Wie zuvor gezeigt, kann eine Kohorte von Würmern verwendet werden, um unmittelbar nach der Konditionierung auf assoziatives Lernen mit siebenfachem Abstand zu testen. Die verbleibende Population der Würmer wird auf 100 Millimeter große HGM-Platten übertragen, auf denen ein Milliliter OP 50 sitzt.

Auch hier gilt: Tragen Sie 100 bis 200 Mikroliter Würmer pro Platte auf, um sicherzustellen, dass genügend Bakterien vorhanden sind, um die Population zu unterstützen. Inkubieren Sie die Nachkonditionierungsplatten bei 20 Grad Celsius für 1624 oder 40 Stunden, die die langfristigen assoziativen Gedächtniszeitpunkte darstellen, um das langfristige assoziative Gedächtnis der bekannten Lebensmittel-Butan-Assoziation zu testen. Waschen Sie die Würmer vorsichtig von den Platten in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und erneut ein- bis zweimal mit M neun Puffer nach jedem Zeitpunkt und testen Sie die Würmer im Chemo-Texas-Assay.

Um die Chemotaxis-Assay-Platten vorzubereiten, markieren Sie den Boden von nicht sitzenden 100-Millimeter-NGM-Platten mit Flecken in der Nähe der Seite an drei Stellen, wie hier zu sehen. Spotten Sie einen Mikroliter eines molaren Natriumazids an den Odorier- und Kontrollpunkten. Nicht länger als 15 Minuten vor Beginn des Assays, um die Diffusion der Lähmungsmittel zu minimieren.

Als nächster Spot je ein Mikroliter 95 % Ethanol und 10 % Buteiner der entsprechenden Punkte auf der markierten Testplatte. Auf dem zuvor gefleckten Natriumazid. Entfernen Sie so viel wie möglich von dem M nine-Puffer aus dem Röhrchen mit den abgesetzten Würmern.

Verwenden Sie ein Pepin-Rohr P 20 mit einer vorgestanzten Spitze, um 15 Mikroliter Würmer in drei Intervallen von fünf Mikrolitern an den Ursprung der Assay-Platte zu bringen. Drehen Sie dann die Ecke eines Kim-Tuchs zu einer kleinen Spitze und tupfen Sie damit den überschüssigen M nine-Puffer ab. Achten Sie darauf, den Agar nicht zu durchstechen.

Durch das Entfernen des überschüssigen Puffers werden die Würmer auf die Assay-Platte freigesetzt. Wenn Sie bildgebende Verfahren zur Zählung von Würmern verwenden, gibt ein Bild des Ursprungs unmittelbar nach dieser Freigabe die Gesamtzahl der Tiere für eine Testplatte an. Inkubieren Sie die Chemotaxis-Assay-Platte nach der Inkubation eine Stunde lang bei Raumtemperatur, zählen Sie die Anzahl der Würmer an den Ursprungs-Ethanol- und Buton-Spots sowie die Gesamtzahl der Würmer auf der Assay-Platte.

Im Allgemeinen befinden sich Würmer, die durch Natriumazid gelähmt sind, in einem Radius von einem Zentimeter um die Flecken und erscheinen gerade. Da viele Tiere gegeneinander gestapelt sind, können Würmer von Hand gezählt oder mit Hilfe von Bildgebungs- und Analysesoftware quantifiziert werden. Wir bevorzugen Letzteres, um die Ergebnisse einfach und zuverlässig zu machen.

Sobald die Würmer am Ursprung Ethanol- und Butonflecken quantifiziert sind, berechnen Sie den KeyAx-Index, wie hier zu sehen. Der typische naive Chemotaxis-Index für Wildtyp-Würmer, die auf 10%Buton ansprechen, liegt bei etwa 0,2. Mast- oder Spaced-Training erhöht den CHEMOTAXIS-Index im Allgemeinen auf 0,7 bis 0,8 zu Zeiten Null, was einen Lernindex von etwa 0,6 ergibt.

Die naive Chemotaxis reagiert sehr empfindlich auf die richtige Wurmpflege. Diese Abbildung zeigt den deutlichen Unterschied in der KI zwischen gut genährten und ausgehungerten naiven Würmern und unterstreicht die Bedeutung der richtigen Technik. Die Gedächtnisleistung spiegelt sich in der Zeit wider, die es dauert, bis der Chemo-Texas-Index wieder auf ein naives Niveau zurückkehrt, wenn der Lernindex bei Wildtyp-Tieren gleich Null ist.

Das assoziative Kurzzeitgedächtnis beginnt nach etwa zwei Stunden des Massentrainings um eine Stunde abzunehmen und ist im Vergleich dazu unabhängig vom Transkriptionsfaktor kreb. Das assoziative Langzeitgedächtnis beginnt in der Regel erst 16 Stunden nach einer bis zu 40-stündigen Dauer des Weltraumtrainings signifikant abzunehmen und ist Creb-abhängig. Bei diesem Verfahren ist zu bedenken, dass Chemotaxis-Assays durch Hunger oder übermäßige Gerüche in der Umgebung beeinflusst werden können und dass das Gedächtnis und Würmer durch zu viel körperliche Erregung gestört werden können.