فأري عزل جزيرة البنكرياس

مرحباً، أنا جريج زوت من مركز جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو (UCSF) لمرض السكري في مختبر بلوستون، وسأعرض لكم اليوم عملية عزل جزر لانجرهانز من الفأر. تتضمن العملية حقن محلول كولاجيناز في بنكرياس فأر مانح من سلالة C3 H، حيث سنقوم بعد ذلك بإزالة البنكرياس وهضمه، ثم تنقية الجزر باستخدام تدرج فيال، ومن ثم اختيارها يدوياً لنقلها في النهاية إلى كبسولة الكلية لفأر مصاب بالسكري من سلالة NOD، والذي سيكون هو المستقبل.

قبل البدء في هذا الإجراء، قمنا بتخفيف محلول ATE في محلول Hanks المنظم المعدل، وقمنا بضبط التركيز بما يتناسب مع سلالة الفئران المستخدمة C3 H. وقد وجدنا أن عملية الهضم تكون أفضل عند استخدام محلول كولاجيناز بتركيز 0.8 mg/mL، وسنستخدم هذا المحلول للحقن في القناة الصفراوية المشتركة لتوسيع البنكرياس. وسيقوم Pavo codre من مركز السكري بتنفيذ الإجراء اليوم؛ حيث سيقوم بحقن المحلول، وفتح جسم الفأر، وكشف الأمعاء، ثم الحقن في القناة الصفراوية المشتركة.

سنقوم برش الفأر بالإيثانول لتثبيت الشعر، ومن ثم سنتحقق من أن الفأر قد تم التضحية به بشكل صحيح عن طريق قرص إصبع القدم. سيقوم بافو الآن بفتح الفأر وكشف الأمعاء والبنكرياس عن طريق إجراء شق في الخط الناصف. كما سيتم قطع الحجاب الحاجز للتأكد من التضحية بالفأر.

قبل أن نبدأ، أود أن أشير إلى بعض التراكيب الهامة. تقع المعدة هنا، حيث يتصل بها البنكرياس من الأسفل في الاثني عشر ومن الأعلى. هذا هو الكبد حيث نجد المرارة والقناة الصفراوية المشتركة، والتي يمكنكم رؤيتها هنا.

لذا، سيقوم بافو بعد ذلك بعزل الأمعاء الدقيقة، وتحديد موضع دخول القناة الصفراوية المشتركة إلى الأمعاء الدقيقة. وبمجرد كشف الأمعاء، نقوم بوضع مشابك على جانبي القناة الصفراوية المشتركة باستخدام مشابك الناموس (mosquito clamps). وقد وجدنا أن هذا يسمح بدخول المزيد من الكولاجينات إلى البنكرياس، بينما تحاول مجموعات أخرى توجيه المشبك فوق القناة الصفراوية المشتركة.

لقد وجدنا أن هذه التقنية أفضل في السماح للإنزيم بدخول البنكرياس. هذا إجراء لطيف؛ حيث يجب تجنب تمزيق الأمعاء.

يجب السماح للملاقط بالاستقرار برفق على جانبي القناة الصفراوية المشتركة. سنقوم الآن بتحديد موقع المرارة، وبمجرد كشف المرارة، سنستخدمها كدليل لحقن الكولاجيناز في القناة الصفراوية المشتركة. يستخدم باول إبرة مقاس 30 gauge مع سرنجة سعة 5 cc تحتوي على 3 mL من محلول الكولاجيناز.

بينما يقوم بإدخال القسطرة في القناة الصفراوية المشتركة، يعمل على توسيع تلك القناة باستخدام محلول الكولاجيناز، ثم يتقدم عبر القناة الصفراوية المشتركة حتى يصل إلى المنطقة القريبة من الأمعاء. وأثناء تقدمه للأسفل، يتم ضخ محاليل الإنزيمات وحقنها في البنكرياس. والآن، بعد أن تمدد البنكرياس بمحلول الكولاجيناز، سيقوم باول بإزالة الملاقط المرقئة، ثم إزالة البنكرياس من الفأر عن طريق فصله بعناية عن الأمعاء.

يقوم بإزالته من المعدة. حسناً، ومن ثم باستخدام الطحال كمقبض، يرفع البنكرياس ثم يقصه ببطء عند القناة الصفراوية المشتركة، وهكذا ينتهي الأمر. يتم كشف البنكرياس ثم يُزال الطحال، وهنا يقوم بإزالة النسيج المساريقي المعوي، وبعد ذلك يُوضع البنكرياس في محلول كولاجيناز بتركيز 2 mg/mL داخل قارورة زجاجية معقمة وتوضع مرة أخرى على الثلج.

سيتم الآن وضع البنكرياس المعزول الذي وضعناه في القوارير الزجاجية في حمام مائي بدرجة حرارة 37 °C لمدة 17 دقيقة تقريباً. لقد وضعناها في حامل مخروطي سعة 50 mil لضمان عدم طفوها. وبمجرد وضعها في الحمام، يبدأ المؤقت وتبدأ عملية الهضم.

بمجرد اكتمال وقت الهضم، تُزال القوارير، ثم يتم رجّها وتفتيتها بلطف. وبمجرد أن تبدأ الأنسجة في التفكك، تُوضع القارورة على الثلج. يوضع مصفاة معقمة فوق بيكر سعة 400 مل يحتوي على محلول غسيل منظم.

يُصب ناتج هضم البنكرياس بعناية عبر المصفاة في محلول الغسيل المنظم. ولأغراض العرض التوضيحي، تم إيقاف تشغيل خزانة السلامة ورفع الزجاج الواقي حتى نتمكن من رؤية ما نقوم به. وبمجرد صب ناتج هضم البنكرياس في الكأس، تُشطف القوارير بنفس محلول الغسيل المنظم، ثم يُوضع محلول الغسيل المنظم فوق المصفاة.

لدينا محقنة مملوءة بمحلول غسيل منظم. سنستخدمها لغسل النسيج بقوة عبر المصفاة. تكمن الفكرة في تحرير أي عيون سائبة غير مرتبطة بالمصفوفة، مع ترك الأغشية والنسيج غير المهضوم على المصفاة.

وعند الانتهاء من غسل النسيج، هذا ما تراه عادةً في نهاية الإجراء. سيتم الآن نقل نسيج البنكرياس الموجود في قاع الأنبوب إلى أنبوبين مخروطيين سعة 50 mil، وسيتم غسل النسيج، ثم خلطه بشكل متجانس، وتوزيعه بالتساوي بحيث نحصل على حجم راسب متساوٍ في كل أنبوب. يتم الآن شطف الكأس بمزيد من محلول الغسل المنظم.

يتم شطف الجوانب لضمان استعادة جميع الأنسجة التي دخلت البيكر مرة أخرى. بعد ذلك، يتم توزيع المحتوى بالتساوي بين أنبوبين، بحيث يحتوي كل منهما على 50 mL. ثم تملأ الأنابيب المخروطية حتى الأعلى بـ wash buffer.

يتم قلب النسيج عدة مرات ثم يوضع في جهاز طرد مركزي. يتم إجراء عملية تدوير سريعة، حيث يُترك جهاز الطرد المركزي ليصل إلى 1000 RPM ثم يتم إيقاف تشغيله.

تكون الأنسجة في هذه المرحلة حساسة للغاية، لذا يجب تجنب ضغطها بشكل مفرط. تُزال الأنابيب، وسنقوم بتكرار خطوة الغسل هذه ثلاث مرات إضافية. هذه هي نهاية الغسلة الثالثة.

يتم نقل مكونات الأنبوب المخروطي سعة 50 ml إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ml، ثم يتم إجراء عملية الطرد المركزي بسرعة 1000 RPM وبعد ذلك يتم إيقافها. يُزال الطافي ويبدأ الجزء الأول من FI Call. نحن الآن في الخطوة التي حصلنا فيها على الراسب من هضم البنكرياس.

سنقوم بإعادة تعليق هذا النسيج بحيث يكون مفككاً جيداً عن الكريات. سنضيف تدرج الكثافة الأول، وهو 1 1 0 8. سنضيف 5 mL إلى كل أنبوب.

يتم بعد ذلك خلط الراسب جيداً في كل من التدرجات. من المهم تحقيق توزيع جيد للأنسجة في التدرج الأكثر كثافة. والآن سنقوم بإضافة طبقة بمقدار 2 mL من كثافة 1.096.

سنقوم بعد ذلك بإضافة طبقة بسماكة 2 mils بكثافة 1 0 6 9، ثم فوقها طبقة بكثافة 1 0 3 7. من المهم أثناء وضع طبقات الكثافة تجنب خلطها. وبذلك تكون جميع الطبقات قد أضيفت إلى الأنبوب.

ويمكنكم رؤية أن هذا هو الجزء العلوي من 1 1 0 8، والجزء العلوي من 9 1 0 9 6، والجزء العلوي من 1 0 6 9 والجزء العلوي من 1 0 3 7. ويمكنكم ملاحظة أن النسيج قد بدأ بالفعل في الانتقال إلى كثافته المناسبة حتى بدون عملية الطرد المركزي الجزئي. يتم رفع سرعة تدرجات الفيال إلى 1800 RPM لمدة 15 دقيقة، وتذكروا إبقاء المكابح متوقفة بعد إخراج الأنابيب من جهاز الطرد المركزي.

يمكنكم رؤية نطاق جيد من أنسجة الجزر بين الطبقتين 0 0 9 6 و0 0 7. والآن، يتمت إزالة الطبقة 0 3 7 للتخلص من أي بقايا أنسجة أو DNA قد يكون قد تحرر أثناء المعالجة. وباستخدام ماصة بلاستيكية معقمة، سيقوم الآن بإزالة طبقة الجزر ونقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 50 mil يحتوي على 25 mils من محلول الغسيل المنظم.

يجب تنفيذ هذه الخطوة بسرعة لأن fol سام لـ eyelets. في الواقع، قمنا بإزالة طبقة 0 6 9 و 0 9 6 بالكامل. يقوم Pavo بقطع الجزء العلوي من ماصة pasture البلاستيكية وشطفها باستخدام محلول الغسيل المنظم.

يتم بعد ذلك طرد عينات العيون مركزياً كما فعلنا سابقاً. يتم رفع سرعة جهاز الطرد المركزي إلى 1000 RPM ثم يتم إيقافه وسحب الراشح. تُغسل العيون ثلاث مرات باستخدام وسط الغسيل.

لقد انتهينا للتو من عملية عزل جزر لانجرهانس، حيث انتقلنا من مرحلة الهضم إلى تدرج الكثافة وصولاً إلى جزر لانجرهانس المنقاة. وبعد الغسلة الثالثة باستخدام محلول الغسيل المنظم، أعدنا تعليق جزر لانجرهانس في وسط RPMI ووضعناها في طبق زراعة أنسجة. هذه الجزر الآن جاهزة للفحوصات المخبرية (in vitro) أو التحضيرات الحية (in vivo) مثل زراعة جزر لانجرهانس.