Name: Disección de un ojo del ratón de un monte entero del epitelio pigmentario de la retina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-27T16:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 47 s
Description: Aprende la disección del ojo de ratón para obtener montajes completos del epitelio pigmentario de la retina. Esta técnica permite estudiar el desarrollo retiniano y enfermedades oculares en modelos murinos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Ciencias de Salud Ambiental [K22ES012264 a AJRB] y una Sociedad Americana del Cáncer InstitutionalResearch Grant [ACS-IRG-00-173-04] piloto projectaward [a AJRB]. También queremos agradecer a los miembros del laboratorio de obispo para la lectura crítica del manuscrito y comentarios sobre el vídeo y Brown Adán, en particular, por el ejemplo de qué no hacer. Agradecemos al Dr. Donald McEwen del Cáncer del Instituto de Investigación de Niños Greehey por permitirnos el uso de su microscopio de disección / cámara de video puesta a punto para el rodaje del vídeo de la disección. Damos las gracias a Daron Brown en Instrumentos Corte para el afilado y reparación de nuestras herramientas de microdisección.

1. Eliminar el tejido extraños desde el exterior del ojo <ol><li> Vierta 1X PBS en la tapa de un plato de 35 mm. El nivel debe estar justo debajo del labio de la tapa. </li><li> El uso de pinzas rectas, los ojos de transferencia (s) del tubo de almacenamiento para el plato de 35 mm. Los ojos se sumergen en PBS, por dos razones: 1. Los tejidos extraños "flotan" fuera del ojo para que pueda ver y quitar con facilidad, y 2. Durante la disección, los ojos, naturalmente, mantienen su forma esférica, mientras que en la suspensión, que le permite trabajar con esta forma en lugar de combatirla. </li><li> Utilizando los dos pares de pinzas en ángulo (45 ° y 15 °), retire suavemente tanto músculo y el tejido conectivo como sea posible, tirando del tejido contra la corriente (es decir, hacia la córnea). Parte del tejido conectivo se mantendrá. Debería hacerse lo posible para exprimir el globo ocular lo menos posible. </li><li> El comercio de su 15 ° para tijeras pinzas de resorte. Mientras mantiene los ojos estable con 45 pinzas °, utilice las tijeras para cortar la primavera del músculo restante y del tejido conjuntivo, así como el nervio óptico. * Consejo: Use el borde exterior de las tijeras para empujar el tejido contra la corriente (hacia la brecha corneo-escleral) y después del ajuste. Continúe hasta que todos los tejidos extraños se ha quitado de la vista. </li></ol> 2. Retire la córnea y el cristalino <ol><li> Con la córnea hacia arriba, use las pinzas de 45 ° a pellizcar un pequeño pliegue en el centro de la córnea. </li><li> Usando las tijeras de primavera, hace una pequeña incisión en la base de la aleta. Dejar de lado la solapa. </li><li> La celebración de los ojos y permanezca con los fórceps, introduzca el extremo inferior de tijera dentro y perpendicular a la incisión y hacer un corte hacia la brecha corneo-escleral. Trate de mantener su hoja inferior bajo el iris para la córnea y el iris se cortan. No corte todo el camino a la brecha corneo-escleral. Mantenga las tijeras inserta en el ojo. </li><li> Usando su pinza de 45 °, gire con cuidado los ojos de manera que las tijeras son paralelas a la línea divisoria corneo-escleral y hacer un pequeño corte. Gire lentamente el Este tiempo 360, haciendo pequeñas incisiones en todos los sentidos. Una vez más, trate de mantener la hoja inferior de la tijera de su primavera bajo el iris lo tanto el iris y la córnea se corta. Levante el iris y la córnea del resto del ojo y desecharlos. </li><li> Inclinación de los ojos de su lado y presione suavemente hacia abajo en la mitad posterior del ojo, lo que obligó a la lente. Deseche los lentes. El interior de la ojera restante está rodeada por la retina neural, lo que debería ser suave y opaca. </li></ol> 3. Trimestre el ocular como resultado, lo que resulta en un 4 - "pétalos", la flor-como la estructura <ol><li> El ojo debe estar colocada de tal modo que la apertura de la ojera es perpendicular a su cuerpo. Utilizar su pinza de 45 ° para mantener el equilibrio y la posición del ocular. </li><li> La celebración de las tijeras de primavera frente a usted lo que son perpendiculares a su cuerpo, introduzca el extremo inferior de las tijeras de su resorte en el borde superior de la copa de los ojos abiertos. Usando su pinza de 45 °, alinee cuidadosamente la copa del ocular para que un solo corte, se puede hacer directamente desde la línea divisoria corneo-escleral hacia la cabeza del nervio óptico. Todos los cortes deben ser perpendiculares a la línea divisoria corneo-escleral y menos que se especifique, debe ir lo más cerca de la cabeza del nervio óptico como sea posible sin cortar en ella. </li><li> Gire el ocular de 180 °, manteniendo la perpendicularidad con su cuerpo. Use la técnica en el paso 3.2 para hacer un corte perpendicular segundo. </li><li> Gire el ocular y repetir la técnica descrita en el apartado 3.2 para hacer dos cortes más. Los cuatro cortes deben ser lo más cercano a 90 º como sea posible. Tenga en cuenta que el ojo no es perfectamente esférica por lo que habrá una cierta variabilidad. </li></ol> 4. Corte cada uno de los cuatro "pétalos" en la mitad, resultando en un niño de ocho pétalos de flores-como la estructura <ol><li> La transferencia de la ojera en cuartos de la antena de 35 mm de una lámina limpia. Con el ocular hacia arriba, en primicia con la pinza de 45 °. Con cuidado, sacarlo del líquido y lo coloca en un portaobjetos limpio. </li><li> Utilizando los dos pares de pinzas en ángulo, abra suavemente el ojo, la retina neural hacia arriba. NO QUITE LA RETINA NEURAL-que ayuda a mantener la vista algunos de su forma esférica por lo que no están trabajando en contra de ella. También protege el EPR de ser dañado accidentalmente en los siguientes procedimientos. </li><li> Mover la tarjeta hasta que uno de los pétalos es perpendicular a su cuerpo. </li><li> Utilice su 15 pinzas °, agarrar suavemente la esquina de los pétalos. La esquina de los pétalos se debe córnea, retina neural o no del EPR. Levante suavemente la esquina, lo que le permite mantener su curvatura. </li><li> Inserte la hoja inferior de las tijeras de muelle entre los pétalos y la corredera. Alinear sus tijeras de tal manera que una sola recta, perpendicular corte puede hacerse desde la línea divisoria corneo-escleral hacia la cabeza del nervio óptico. Cortar tan cerca de la cabeza del nervio óptico como withou posiblet reducción en el mismo. Dejar de lado el pétalo, lo que le permite estar en la diapositiva. </li><li> Mover la tarjeta de 90 °, de modo que el pétalo siguiente es perpendicular a su cuerpo. Repita el paso 4.5. </li><li> Repita los pasos 4.5 y 4.6 veces más. La estructura resultante debe ser similar a una flor de ocho pétalos. </li></ol> 5. Retire la retina neural <ol><li> Pipeta de 100 a 200 l de PBS 1X a la muestra. Esto evitará que la retina neural se pegue a medida que despegarlo de la RPE. </li><li> Normalmente, la retina neural se unen libremente a la RPE. Sin embargo, se necesita práctica y habilidad para eliminar sólo la retina neural y no del EPR. Pellizque suavemente un pétalo de la retina neural con un par de pinzas en ángulo, mientras que la estabilización (manteniendo pulsado) el resto del ojo con el otro par de pinzas de ángulo. Tire de la retina neural del resto del ojo. Repita este procedimiento hasta que la retina neural todo ha sido eliminado. * Consejo: pegar la punta de la pinza de 15 ° en la cabeza del nervio óptico para anclar el ojo. A continuación, utilice las pinzas de 45 ° para barrer debajo de la retina neural y lo despega y lejos. Por lo general, la mejor manera de levantar la retina neural de la cabeza del nervio óptico hacia la brecha corneo-escleral. Asegúrese de tirar a la basura cualquier restos sueltos del iris. El iris es muy pegajosa y de lo contrario pueden quedar atrapados en el RPE. </li><li> Enjuagar la muestra con PBS 1X. Pipeta de 100 a 200 l de PBS 1X en la muestra y chupar una copia de seguridad. Deseche la PBS. Repita según sea necesario para eliminar el polvo y los escombros. </li></ol> 6. Montaje que muestra (s) en una diapositiva <ol><li> Pipeta de 80 a 90 l de 90% de glicerol en una nueva diapositiva en una forma rectangular. Use el lado de la punta de la pipeta para hacer un frotis, incluso, rectangular de glicerol. (Este es el procedimiento para el montaje de dos EPR en una diapositiva.) </li><li> Inserte el brazo inferior de 15 ° bajo unas pinzas de la muestra. Levante suavemente la muestra fuera de la diapositiva de disección. </li><li> Baje lentamente la muestra en el glicerol. Suavemente mueva la pinza a medida que los saca de debajo de la muestra. </li><li> Repita los pasos 6.1-6.3 para el otro espécimen. </li><li> Mover la tarjeta a fin de que el lado más largo es perpendicular a su cuerpo. Mantenga la cubierta de vidrio a un ángulo de 45 ° a la diapositiva de modo que está en contacto con la diapositiva. Se mueven hacia el frotis de glicerina hasta que se toquen. Mantener el contacto entre la cubierta de vidrio y de diapositivas, mueva lentamente la tapa de vidrio lejos de la mancha, hacia el borde de la diapositiva. Alinee los lados largos de la diapositiva y la cubierta de vidrio para que sean paralelas. Mantenga las esquinas de la cubierta de vidrio entre los dedos pulgar e índice. </li><li> Recoge el 15 ° en fórceps la otra mano. Cuna de la parte superior (gratuito) borde de la cubierta de cristal en la parte interior del brazo. Muy lentamente, baje la tapa de vidrio. Cuando se hace el contacto entre la cubierta de vidrio y el glicerol, parar y esperar a que el glicerol a emigrar. Repita este descenso y esperar hasta que el conjunto se monta RPE están completamente cubiertos. Esto es para prevenir el glicerol de alta viscosidad de la captura de burbujas de aire. NO empuje hacia abajo en el cubre - el glicerol se exprima debajo de él, haciendo una adherencia muy pobre. </li><li> Con esmalte transparente de uñas, pintura de todo el perímetro donde el cristal de la cubierta y deslice cumplir. </li><li> Colocar la placa en la parte superior de un estante vacío que se seque. </li></ol> 7. Los resultados representativos: El resultado de este procedimiento debe ser una estructura que se parece a una flor y debe ser bastante simétricas. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Todo RPE montaje de un ratón de tipo salvaje C67Bl/6J. RPE de color negro o agouti animales debe ser de color marrón oscuro y debe tener una superficie lisa. Es normal observar ondulaciones en la topografía de los pétalos. La pigmentación en cualquier muestra de dar puede ser algo variable, debido a la densidad variable de pigmentación tanto de la EPR y la coroides subyacente. Las flechas blancas señalan hipopigmentadas "canales" - esto es normal y es debido a la vascularización subyacente del ojo. Puntos de flecha azul a los daños físicos tanto a la EPR y la coroides subyacente. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Todo RPE montaje de un ratón diluido. Muestras recolectadas de animales diluidos puede variar en color de casi transparente a café con leche y cualquier espécimen es como tener la variabilidad dentro de ella, se indica en los círculos negro aquí. En general, RPE cosecha de los animales más jóvenes son más ligeros y los cosechados de los animales más viejos son más oscuras. Flechas de color negro indican algunos de los vasos subyacentes, que aparece hipopigmentadas. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Tinción phalloidin se puede utilizar para detectar daños físicos a la RPE. Tinción faloidina define claramente las membranas celulares, mostrando la forma hexagonal del epitelio. (A) Ejemplo de un ratón negro. (B) Ejemplo de un ratón diluido. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Un RPE mal disecado de un ratón diluido. (A) Los corchetes indican los márgenes de la córnea que son demasiado grandes, que pueden causar la deformación y / o plegables. Dentro del círculo negro se puede ver una cantidad excesiva de tejido extraño que no se han retirado de la parte posterior del ojo. Son particularmente evidente, porque la muestra es de un animal diluido. El pétalo de abajo a la izquierda está parcialmente doblada. (B) Este monte se tiene la apariencia de un molinillo de viento. Flechas de color negro indican algunos de los cortes que se hicieron. Muchos de los cortes de la brecha corneo-escleral hacia la cabeza del nervio óptico no están en línea con el diámetro. (C) flechas Negro indican cómo los recortes que se han hecho, de acuerdo con el diámetro y la perpendicular a la tangente.

<ol><li>Bishop, A. J., Kosaras, B., Sidman, R. L., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzo%28a%29pyrene+andX-rays+induce+reversions+of+the+pink-eyed+unstable+mutation+in+the+retinal+pigmentepithelium+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.%22%5BJournal%5D)">Benzo(a)pyrene andX-rays induce reversions of the pink-eyed unstable mutation in the retinal pigmentepithelium of mice.</a> Mutat. Res.. 457, 31-31 (2000).</li>
<li>Reliene, R. H. lavacove, Mahadevan, A., Baird, B., M, W., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diesel+exhaust+particles+cause+increased+levels+of+DNA+deletions+after+transplacental+exposure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Diesel exhaust particles cause increased levels of DNA deletions after transplacental exposure in mice.</a> Mutat. Res. 570, 245-2452 (2005).</li>
<li>Bishop, A. J., Barlow, C., Wynshaw-Boris, A. J., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atm+deficiency+causes+increased+frequency+of+intrachromosomal+homologous+recombination+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Atm deficiency causes increased frequency of intrachromosomal homologous recombination in mice.</a> Cancer Res. 60, 395-399 (2000).</li>
<li>Brown, A. D., Claybon, A. B., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+WRN+helicase+domain+is+not+required+for+spontaneous+homologous+recombination-mediated+DNA+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Mouse WRN helicase domain is not required for spontaneous homologous recombination-mediated DNA deletion.</a> J. Nucleic Acids. , (2010).</li>
<li>Claybon, A., Karia, B., Bruce, C., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP1+suppresses+homologous+recombination+events+in+mice+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PARP1 suppresses homologous recombination events in mice in vivo.</a> Nucleic Acids Res. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53-%2C+and+Gadd45a-deficient+mice+show+an+increased+frequency+ofhomologous+recombination+at+different+stages+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">p53-, and Gadd45a-deficient mice show an increased frequency ofhomologous recombination at different stages during development.</a> Cancer Res. 63, 5335-5343 (2003).</li>
<li>Bodenstein, L., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+development+of+the+mouse+retinalpigment+epithelium.+Part+I.+Cell+and+tissue+morphometrics+and+topography+of+mitoticactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth and development of the mouse retinalpigment epithelium. Part I. Cell and tissue morphometrics and topography of mitoticactivity.</a> Dev Biol. 121, 192-204 (1987).</li>
<li>Burke, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+phenotype+and+the+RPE%3A+is+the+answer+blowing+in+the+Wnt%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Epithelial phenotype and the RPE: is the answer blowing in the Wnt?</a> Prog Retin. Eye Res. 27, 579-595 (2008).</li>
</ol>

El EPR es el sitio de la prueba de p de la ONU, un ensayo in vivo de la homología dirigida reparación. El ensayo de p de la ONU ha sido utilizado para estudiar los efectos de los daños del ADN diferentes 1,2 y señalización daño en el ADN y los genes de reparación 3,4,5 de la frecuencia de homología dirigida reparación. Este ensayo es muy sensible, la detección de una sola célula eventos en el RPE 1. También puede detectar diferencias en el...

<table><tbody><tr><td>pinzas rectas</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-4903</td><td>punta: .08 x .04 mm material: INOX</td></tr><tr><td>pinzas de 45&amp;#x00B0;</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5005</td><td>punta: .05 x .01 mm material: INOX</td></tr><tr><td>pinzas de 15&amp;#x00B0; &quot;hacia arriba&quot;</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5045A</td><td>punta: .1 x .06 mm material: INOX</td></tr><tr><td>tijeras de resorte</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5604</td><td>ancho de punta combinada 0,3 mm, longitud del filo de corte 3 mm, material: acero inoxidable</td></tr><tr><td>microscopio estereoscópico binocular</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Discovery V.8</td><td>usar fuente de luz reflejada</td></tr><tr><td>faloídicina</td><td>Invitrogen</td><td>A22283</td><td>Alexa Fluor 546</td></tr></tbody></table>

disección de un ojo del ratón de un monte entero del epitelio pigmentario de la retina

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

El epitelio pigmentario retiniano (EPR) se encuentra en la parte posterior del ojo de los mamíferos, justo debajo de la retina neural, que contiene los fotorreceptores (conos y bastones). El EPR es una monocapa de células pigmentadas cúbicas y asociados estrechamente con la retina neural justo encima de él. Esta asociación hace que el RPE de gran interés para los investigadores que estudian enfermedades de la retina. El EPR es también el sitio de un ensayo in vivo de la homología dirigida por la reparación del ADN, la prueba de p de la ONU. El ojo del ratón es particularmente difícil de analizar debido a su pequeño tamaño (alrededor de 3,5 mm de diámetro) y su forma esférica. En este artículo se demuestra con todo detalle un procedimiento para la disección del ojo que resulta en un montaje conjunto de la RPE. En este procedimiento, se muestra cómo trabajar con y no contra, la estructura esférica del ojo. En pocas palabras, el tejido conectivo, el músculo y el nervio óptico se eliminan de la parte posterior del ojo. Luego, la córnea y el cristalino se eliminan. A continuación, se hacen cortes estratégicos que dan lugar a aplanamiento significativo del tejido restante. Por último, la retina neural se levanta suavemente, dejando al descubierto un EPR intacto, que aún está unido a la coroides y la esclera subyacente. Este monte se puede utilizar para realizar el ensayo de la ONU o p para la evaluación de inmunohistoquímica o inmunofluorescencia el tejido de RPE.

Una demostración formal de la disección de un ojo del ratón, lo que resulta en un montaje de todo el epitelio pigmentario de la retina.

Disección de un ojo del ratón de un monte entero del epitelio pigmentario de la retina

El epitelio pigmentario retiniano (EPR) se encuentra en la parte posterior del ojo de los mamíferos, justo debajo de la retina neural, la cual contiene los fotorreceptores (bastones y...

Me llamo Allison Clavon. Soy ayudante de investigación del Dr. Alex Bishop en el Instituto de Investigación sobre el Cáncer Infantil Gree del Centro de Ciencias de la Salud de la UT en San Antonio, Texas. Hoy voy a demostrar cómo diseccionar un ojo de roedor para obtener una muestra completa del epitelio pigmentario retiniano.Este tejido es de interés para el estudio del desarrollo y las enfermedades de la retina, y también es el sitio de un ensayo de reparación dirigida del ADN por homología in vivo. Así que comencemos. Aquí hay un ojo listo para la disección.Primero, analicemos las estructuras anatómicas que utilizará como puntos de referencia durante todo el procedimiento. Estos son los ojos de un animal diluido. Aquí se encuentra el nervio óptico en la parte posterior del ojo opuesto.Ese es el cristalino. El iris se ve a través del cristalino. El área blanquecina en la parte posterior del ojo es la esclerótica.Por lo tanto, esta región se denomina límite esclerocorneal. El primer paso de la disección consiste en eliminar tejidos accesorios como el tejido conectivo muscular y el nervio óptico. A continuación, debe extraerse la córnea, realizando un corte circular.En este punto, se puede extraer el cristalino, lo que resulta en una copa óptica hueca. A continuación, se realizan cuatro cortes desde la división esclerocorneal hacia la cabeza del nervio óptico. La estructura resultante se asemeja a una flor de cuatro pétalos.Cada uno de estos cuatro pétalos se corta luego por la mitad, obteniendo una estructura que se asemeja a una flor de ocho pétalos. En esta etapa, la I puede presentar abultamientos en algunas zonas debido a su naturaleza esférica. Para contrarrestar esto y lograr una montura de orificio más plana, se pueden hacer ocho cortes más cortos justo más allá de los abultamientos.Necesitará varios materiales a mano en su estación de trabajo, incluyendo un pipeta de 100 o 200 µL y puntas correspondientes, un portaobjetos X-P-B-S-A de 35 milímetros con cubreobjetos, glicerol al 90 % y esmalte de uñas transparente para la preparación de portaobjetos, un portaportas para secar los portaobjetos, una caja de toallitas Kim y un recipiente de desecho de cintura. Además de estos materiales comunes, también necesitará un juego de herramientas especializadas para microdisección, incluyendo pinzas rectas; pinzas anguladas a 45 grados se utilizan para sostener, girar y manipular generalmente el ojo durante toda la disección. Estas pinzas de 15 grados tienen un ángulo hacia arriba y también se usan para manipular y manejar el ojo.Finalmente, necesitará un par de tijeras de resorte. Es muy importante que utilice tijeras de resorte en lugar de tijeras de estilo tradicional. Para esta disección, antes de comenzar, asegúrese de ajustar la altura de su silla de manera que, al sentarse erguido, sus ojos estén al nivel de los oculares.Encorvarse sobre el microscopio provoca dolor de hombros y espalda e inhibe la calidad de sus disecciones. Para comenzar, vierta un XPBS en la tapa del recipiente de 35 milímetros. Luego, transfiera los ojos que planea diseccionar al recipiente.Este es un ojo de un ratón C57 negro de tipo silvestre. Puede observarse muy pequeño, con un diámetro de aproximadamente tres milímetros y medio. La opacidad de la esclerótica le confiere un tono azulado.El primer paso en la disección consiste en eliminar todos los tejidos extraños alrededor del ojo, como el tejido conectivo muscular y el nervio óptico. Aquí tengo las pinzas de 45 grados en la mano izquierda y las pinzas de 15 grados en la derecha. Puede utilizar un par de pinzas para sujetar el ojo mientras tira del tejido con el otro par.Cuando se desprenda un trozo grande de tejido, limpie cuidadosamente la pinza sobre una toalla Kim. Tenga cuidado de no aplastar ni perforar el ojo. Uno de los beneficios de realizar esta disección en suspensión es que puede ver fácilmente el tejido conectivo alejándose del ojo.Finalmente, llegará un punto en el que ya no pueda eliminar más tejido con pinzas. Sustituya sus pinzas con ángulo de 15 grados por tijeras de resorte. Utilice las tijeras de resorte para cortar el nervio óptico.Utilice el borde exterior de la hoja para empujar el tejido hacia adelante, en dirección a la división esclerocorneal. Luego, corte y limpie suavemente las tijeras sobre una toallita kim. Veámoslo nuevamente.Empuje el tejido hacia adelante, en dirección a la división corneoescleral, con el borde exterior de las tijeras cuando el tejido esté levantado. Recorte, siga empujando los fragmentos de tejido hacia adelante con el borde romo de las tijeras y luego elimínelos mediante recortes, hasta que todo el tejido extraño haya sido removido. Por lo general, hay dos bandas de tejido resistente en el ojo.El primero está unido en la división esclerocorneal, y el segundo se muestra mientras se recorta. Aquí está aproximadamente a mitad de camino entre la división esclerocorneal y la cabeza del nervio óptico. El siguiente paso en la disección consiste en retirar la córnea y el cristalino.Utilice la pinza de 45 grados para elevar un colgajo aproximadamente en la mitad de la córnea. Luego, use las tijeras de resorte para realizar una pequeña incisión en la base del colgajo. Introduzca la hoja inferior de las tijeras en la incisión, por debajo del iris.Realice un corte hacia, pero sin llegar a, la división esclerocorneal. Ahora, gire lentamente el ojo 360 grados, realizando pequeños cortes alrededor. Intente mantener las tijeras por debajo del iris, cortando simultáneamente la córnea y el iris.Se necesita mucha práctica para hacerlo tan fácilmente como lo muestro aquí. Una vez que se ha retirado la córnea, gire el ojo sobre su costado y presione suavemente sobre la parte externa del ojo para expulsar el cristalino. La estructura restante tendrá forma de copa a continuación.El ojo debe dividirse en cuartos. Para hacerlo, gire el ojo sobre su costado e inserte la hoja inferior de sus tijeras de resorte. Realice un corte longitudinal hacia, pero sin llegar hasta, la cabeza del nervio óptico.Para hacer esto, mantenga los brazos a los lados y las tijeras frente a usted, aproximadamente perpendiculares a su cuerpo y al corte del ojo. Realice el segundo corte directamente opuesto al primer corte. Tómese su tiempo para alinear correctamente y poder hacer un corte suave.Realizar múltiples cortes puede causar irregularidades, pero si se alinean cuidadosamente, no son perceptibles; observe cómo puedo trabajar con esta forma esférica del ojo en lugar de en contra de ella, ya que el ojo mantiene su forma normal. Cuando esté suspendido en PBS, el resto de la disección se llevará a cabo sobre un portaobjetos. Sostenga el ojo con la pinza en ángulo de 45 grados y levántelo del PBS.Coloque el ojo sobre un portaobjetos nuevo. Con ambas pinzas anguladas, desdoble cuidadosamente el ojo. Observe que hay un pequeño margen de córnea e iris alrededor del perímetro del ojo, lo cual es útil para manipularlo.A continuación, debe cortar cada uno de los cuatro pedales por la mitad. Gire el ojo de modo que uno de los pedales quede perpendicular a su cuerpo. Sujete la esquina del pedal con la pinza en ángulo de 15 grados.Levante ligeramente y luego realice un corte desde la división esclerocorneal hacia el polo óptico. Estos cortes deben ser perpendiculares a una tangente. Una tangente es una línea que es perpendicular al diámetro.Por lo tanto, sus cortes deben estar alineados con el diámetro del ojo. Ahora gire el portaobjetos para que el siguiente pétalo quede perpendicular a su cuerpo y repita. Sujete la esquina del pétalo.Levante ligeramente y corte. Repita hasta que cada uno de los cuatro pedúnculos grandes haya sido cortado por la mitad. La sustancia de color blanquecino es la retina neural, que se encuentra directamente encima del epitelio pigmentario de la retina (RPE).La retina neural puede proteger el epitelio pigmentario de la retina (RPE), así que déjela intacta hasta que haya realizado todos los cortes. Observe cómo las pétalos están ligeramente curvados. No intente contrarrestar esto.Tómese su tiempo para alinear correctamente y poder realizar un buen corte único. Debido a que el ojo es redondo, tiende a plegarse; para evitar este plegamiento, puede hacer ocho cortes cortos.Uno en cada pétalo. Utilice la misma estrategia básica que en la ronda anterior de cuatro cortes. Levante la esquina del pétalo y corte, pero en este caso, corte solo aproximadamente hasta la mitad de la longitud del pétalo.Una vez que haya realizado todos los cortes, puede retirar la retina neural. Aquí estoy agregando unas gotas de PBS 1X al espécimen. No debe dejar que su epitelio pigmentado de la retina se seque.La retina neural solo debería estar débilmente asociada con el epitelio pigmentario retiniano subyacente. Se puede observar que se separa bastante fácilmente. Sin embargo, normalmente permanecerá adherida en la división corneoescleral, que en el interior del ojo es una cresta irregular denominada cuerpo ciliar.Puede insertar la punta de la pinza de 15 grados en el nervio óptico para fijar la muestra mientras se separa la retina neural. El cuerpo ciliar marca el borde del epitelio pigmentario de la retina (RPE), el tejido de pigmentación oscura que se ha desprendido. Aquí se encuentra el iris, no el RPE.Recomiendo eliminar la mayor cantidad posible del iris porque es muy pegajoso y puede plegarse y adherirse al epitelio pigmentario de la retina (RPE) si la retina neural está desprendiéndose o si quedan restos adheridos al RPE. Probablemente ocurrió una de dos cosas: o los ojos no se fijaron adecuadamente, ya sea durante demasiado tiempo o por un periodo demasiado corto, o estuvieron en almacenamiento durante demasiado tiempo antes de la disección.El pedal que estoy descubriendo aquí aún no tiene su acceso directo. Puede observarse cómo el pedal se encuentra aproximadamente a un tercio del camino desde el borde del EPR. Por esta razón se recomiendan los ocho accesos directos.Una vez descartada toda la retina neural, use una pipeta para enjuagar varias veces el epitelio pigmentario de la retina (RPE) con 100 a 200 microlitros de PBS hasta eliminar todo el polvo y los residuos. Aplique con pipeta 80 a 90 microlitros de glicerol al 90 % sobre un portaobjetos nuevo en forma rectangular. Tenga en cuenta que este es el volumen óptimo de glicerol para una cubreobjetos de 22 por 50 milímetros y debe ajustarse según corresponda.Para otros tamaños de cubreobjetos, use la punta de su pipeta para extender el glicerol. Tenga cuidado de no añadir burbujas de aire al glicerol. Si aparece una burbuja, arrástrela hacia el borde donde reventará.Deslice el brazo inferior de la pinza de 15 grados por debajo del epitelio pigmentario de la retina (RPE) y levántelo con cuidado; luego, baje lentamente el RPE en el glicerol. El RPE flotará sobre la superficie del glicerol y podría enrollarse o torcerse ligeramente. Utilice la pinza para enderezar el RPE y para arrastrar el glicerol sobre su superficie.Si se forman burbujas de aire, arrástrelas hacia el borde, donde estallarán, sosteniendo el cubreobjetos a unos 45 grados. Tóquelo en el borde del glicerol.Luego muévalo hacia el borde del portaobjetos. Sujete la parte inferior del cubreobjetos con el pulgar y el índice y sostenga el borde opuesto con unas pinzas de 15 grados. Baje muy lentamente el cubreobjetos hacia el portaobjetos tan pronto como se establezca el contacto.Con el EPR, detenga el descenso, permitiendo que la glicerina migre mientras continúa bajando lentamente su cubreobjetos. Si baja el cubreobjetos demasiado rápido, se incorporarán burbujas de aire en su preparación en este punto. Bajaré el cubreobjetos lentamente cuando toque el EPR y permitiré que la glicerina migre.Puede observarse que cuando suelto rápidamente el cubreobjetos, se incorporan burbujas de aire. Utilice una cantidad generosa de esmalte de uñas transparente para fijar el borde del cubreobjetos al portaobjetos, rodeando completamente todo el perímetro.Este es un epitelio pigmentario retiniano típico de un ratón negro C57. Es normal observar la vasculatura subyacente, como se indica aquí. También es normal observar cierta variación en la pigmentación, como manchas que parecen tener menos pigmento.Sin embargo, las manchas claras como esta probablemente se deban a un daño físico en el epitelio pigmentario de la retina (RPE) y en la coroides subyacente. Dado que la coroides del ojo también está pigmentada, es posible que un daño en un RPE oscuro pase desapercibido si la coroides permanece intacta.Este es un epitelio pigmentario retiniano (RPE) típico de un ratón diluido. Como se indica, podrá observarse la vasculatura y habrá cierta variación en la pigmentación, como manchas más oscuras y manchas más claras. Sin embargo, es casi imposible observar daño en un RPE diluido.¿Son estos pequeños parches daño o una variación normal en la pigmentación? Sugiero realizar frotis y tinción para abordar esta pregunta. Esto le dará una idea si está manipulando el I dos de forma demasiado brusca.La tinción delinea claramente las membranas celulares, haciendo evidentes las zonas dañadas, pero en realidad, el epitelio pigmentario retiniano es bastante resistente, y si manipula el ojo por la córnea, es poco probable que cause daño. Aquí se muestra una preparación completa con una serie de problemas, siendo el menor de ellos el margen excesivamente amplio de córnea, lo cual puede provocar arrugas y plegamientos del material ondulado. Puede observarse aquí un tejido extraño masivo que permanece en la parte posterior del ojo.Este pétalo está parcialmente doblado, y aquí puede observarse que el epitelio pigmentario retiniano (RPE) ha sido parcialmente desgarrado. Otro problema es que este ojo presenta el aspecto de una rueda de fuegos artificiales. Aquí he dibujado los ángulos de los cortes.Sin embargo, así es como deberían haber sido. Recuerde, sus cortes deben ser perpendiculares a la tangente y alineados con el diámetro. Acabo de demostrar cómo diseccionar un ojo de ratón para un montaje completo del epitelio pigmentario de la retina.Epitelio, lo más importante es mantener una buena postura, pero intenta permanecer relajado. Espero que hayas encontrado útil este video y te deseo todo lo mejor en tus futuros experimentos.

dissection-mouse-eye-for-whole-mount-retinal-pigment

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

La técnica de disección ilustra la evisceración del vítreo, la retina y el cristalino del ojo del ratón, la separación por centrifugación, y la caracterización de los ensayos de proteínas.

Evisceración de vítreo y retina del ratón para análisis proteómico

La técnica de disección ilustra la enucleación del ojo del ratón para la fijación del tejido para realizar el fenotipado de alto rendimiento pantallas.

Ratón enucleación del ojo por remoto de alto rendimiento fenotipificación

El protocolo descrito aquí es para la evaluación estructural de una preparación de retina de montaje completo. Esto incluye descripciones de la disección de tejidos, el montaje en un inserto de membrana de politetrafluoroetileno (PTFE) hidrofilizado, la carga en bolo con marcadores fluorescentes y una comparación de la fijación con carbodiimida y paraformaldehído para el análisis inmunohistoquímico de componentes celulares y sinápticos.

Protocolo optimizado para Retina Preparación Wholemount de la Imagen y la inmunohistoquímica

Este informe describe métodos completos para preparar secciones de retina de ratón congeladas para inmunohistoquímica (IHC).  Los métodos descritos incluyen disección de la copa ocular posterior, fijación de paraformaldehído, incrustación en la temperatura de corte óptima (OCT) orientación de medios y tejidos, seccionamiento e inmunomancha.

Preparación de criosecciones retinianas de ratón para inmunohistoquímica

Este protocolo, que fue reportado originalmente por Fernandez-Godino et al. en 20161,describe un método para aislar eficientemente y cultivo de células RPE del ratón, que forman una monocapa RPE funcional y polarizada dentro de una semana en las placas Transwell. El procedimiento dura aproximadamente 3 horas.

Disección eficiente y cultivo de células epiteliales de pigmento retiniano de ratón primario

Este artículo presenta un protocolo para la microdisección ocular en roedores. El proceso implica la enucleación del globo ocular junto con la membrana nictitante (es decir, el tercer párpado). Esto es seguido por la separación de las copas oculares posterior y anterior.

Microdisección del ojo de roedor

Los modelos de ratón pueden ser herramientas útiles para investigar la biología del epitelio pigmentado de la retina (EPR). Se ha establecido que los ratones pueden desarrollar una serie de patologías del EPR. Aquí, describimos un protocolo de fenotipado para dilucidar y cuantificar patologías de EPR en ratones utilizando luz, electrones de transmisión y microscopía confocal.

Un protocolo para evaluar y cuantificar patologías del epitelio pigmentado retiniano en modelos murinos de degeneración macular relacionada con la edad

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) actúa como una barrera crucial entre la coroides y la retina, promoviendo la salud y la función de los tipos de células de la retina, como los fotorreceptores. En este trabajo se describe un protocolo sencillo y eficaz para el aislamiento y cultivo de EPR murino adulto.

Un método simplificado para el aislamiento y cultivo de células epiteliales pigmentarias de la retina de ratones adultos

Este protocolo describe el procedimiento para aislar la retina de ratón de montaje completo y realizar inmunotinción para marcar todas las células ganglionares de la retina (RGC). Al proceso le siguen las imágenes y el recuento automático de las RGC mediante un software basado en IA, lo que proporciona un método sencillo, rápido y preciso para cuantificar las RGC en toda la retina del ratón.

Inmunotinción de montaje completo y recuento automático de células ganglionares de la retina de ratón

Se describe un protocolo para preparar criosecciones de retina en ratones y realizar inmunotinción en fotorreceptores. Este artículo permite a los investigadores producir de forma consistente secciones congeladas de retina de ratón con una morfología bien conservada y resultados de inmunotinción de alta calidad.

Criosección e inmunotinción de retina de ratón

La retina exhibe una organización espacial compleja a través de su estructura laminar. La transcriptómica espacial moderna y las técnicas de secuenciación requieren secciones de tejido &lt; 20 μm de grosor, lo que limita su aplicabilidad en la investigación de la retina. Este método de criosección recién congelada produce secciones delgadas en la cara de la retina del ratón al tiempo que preserva las relaciones espaciales planas, lo que permite un mapeo molecular completo a través de las...

En la cara Crioseccionamiento de retina de ratón para análisis molecular espacial de alta dimensión

Aprende la disección del ojo de ratón para obtener montajes completos del epitelio pigmentario de la retina. Esta técnica permite estudiar el desarrollo retiniano y enfermedades oculares en modelos murinos.

Disección de un ojo del ratón de un monte entero del epitelio pigmentario de la retina

Explorar más videos