Всего Запись сотовый от органотипической Подготовка Кусочек Неокортекс

Общая цель этой процедуры заключается в получении электрических записей от параметаллических нейронов в органотипических срезах неокортекса. Это достигается путем первого срезания острых срезов у крыс в постнатальном возрасте от 8 до 10 лет. Вторым этапом процедуры является воздействие Bic на трансфекцию CD NA. Третьим этапом процедуры является культивирование срезов в течение трех-семи дней.

Заключительным этапом процедуры является получение электрических записей от трансфицированных клеток с помощью токовых или электрических клещей. В конечном счете, могут быть получены результаты, показывающие, что клетки параметалла в органотипических срезах имеют свойства, аналогичные тем, которые были получены в острых срезах того же возраста. Трансфекция GFP не изменяет эти свойства, что позволяет изучать нейроны после генетических манипуляций с ионными каналами с помощью записи тока или напряжения во всей клетке.

Главное преимущество этого метода заключается в том, что в отличие, скажем, от острых срезов, клетки могут сохраняться в нормальной среде достаточно долго, чтобы иметь возможность генетически манипулировать ионными каналами. Метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области ионных каналов, такие как функциональные роли конкретных типов ионных каналов, подготовка ламинарного проточного колпака, вакуумного проточного колпака, хирургические принадлежности и решения, как указано в сопроводительной рукописи. На все последующие этапы надевайте перчатки, предварительно процедив приготовленный 250 миллилитровый режущий раствор из 40 миллилитров в 50-миллилитровую мензурку.

Поместите режущую камеру, 40 миллилитров аликвоты, и оставшиеся 210 миллилитров режущего раствора в морозильную камеру при температуре минус 20 градусов Цельсия под ламинарный вытяжной шкаф. Поместите 1,1 миллилитра питательной среды в три диагональные лунки шестилуночной пластины. Повторите это на секунду.

Шестилуночная пластина. Поместите шесть луночных планшетов в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия не менее чем на один час. Затем с помощью стерильных ножниц укоротите четыре переводные пипетки, которые будут использоваться для переноса ломтиков.

Еще три пипетки остаются нетронутыми, когда растворы стали слякотными смесями. Достаньте из морозилки 40 миллилитров аликвоты режущего раствора и положите его под вакуумную вытяжку. Наполните его 95% кислородом, 5% углекислым газом.

Затем достаньте 210 миллилитров раствора для резки из морозилки и положите его под пузырь с ламинарным потоком вытяжки. Он также содержит 95% кислорода, 5% углекислого газа. Затем достаньте моющий материал из холодильника и продуйте его со 100% кислородом под вытяжкой с ламинарным потоком.

Поместите два миллилитра питательных сред в чашку Петри. Поместите оставшиеся питательные среды в холодильник для смены сред в течение недели, чтобы подготовиться к срезу мозга. Налейте около 10 миллилитров раствора холодной резки из 50-миллилитрового стакана в 25-миллилитровый стакан под вакуумным колпаком.

После анестезии и обезглавливания удалите мозг из послеродового дня, от восьми до 10 крыс. Промойте мозг в стакане, содержащем 30 миллилитров раствора холодной резки, в течение примерно 30 секунд. Затем аккуратно переложите мозг в стакан объемом 25 миллилитров.

Смените перчатки и пропитайте перчатки этанолом. Затем перенесите мозг в растворе холодной резки к ламинарному вытяжному шкафу. Следующим шагом является ориентация и блокировка мозга путем удаления мозжечка и лобного полюса и частичного среднего сагиттального разреза, склеивания заблокированного мозга на сцене лобной корой вверх.

При необходимости сделайте дополнительные надрезы скальпелем, чтобы ограничить размер срезов. Затем поместите столик с мозгом в стерилизованную металлическую камеру для нарезки. Приложите к вибрирующему тканевому слайсеру.

Наполните ванну ледяным раствором для резки пузырей. Налейте 30 миллилитров оставшегося режущего раствора в 50-миллилитровый стакан и пузыритесь с 95% кислорода, 5% углекислого газа. Этот стакан будет использоваться для сбора ломтиков.

Разрежьте корональные срезы лобной теменной коры размером 250 мкм. Поместите не менее шести ломтиков в пикер объемом 50 миллилитров, содержащий раствор для резки. Далее поместите около двух миллилитров промывочного материала в 35-миллиметровую чашку Петри.

С помощью отрезанной пипетки переложите ломтики из режущего раствора в чашку Петри, содержащую промывочный материал. Трижды промыть срезы свежими пипетками для добавления среды и для аспирации отработанных растворов после промывки перенести срезы в 35-миллиметровую чашку Петри, содержащую питательные среды. Далее снимите с упаковки верхушки для сетчатых вкладышей, но оставьте вкладыши в пакетах.

Затем с помощью щипцов вытащите одну сетчатую вставку из упаковки с помощью разрезанной переводной пипетки. Переложите один срез из питательной среды в сетку. Вставьте и расположите ломтик в середине мембраны с помощью неповрежденной трансферной пипетки.

Удалите излишки питательных сред. Сейчас. Поместите сетчатую вставку с ее срезом в одну из заполненных жидкостью лунок шестилуночной пластины. Будьте осторожны, чтобы не допустить образования пузырьков воздуха под сеткой после помещения по одному срезу в каждую из заполненных жидкостью лунок.

Поместите обе шестилуночные пластины обратно в инкубатор и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение часа. Тем временем очистите рабочую зону под ламинарным колпаком для подготовки к трансфекции. Следующим шагом будет зарядка генной пушки BioRad Helios, оставив первую позицию свободной.

Зарядите патрон, содержащий пули с покрытием CD NA, во все остальные позиции патронного держателя генного пистолета. Затем поместите держатель патрона в генную пушку. Во-первых, очистите оружие, стреляя из ствола без пуль.

Затем продвигаем ствол к картриджу, содержащему CDNA. Пули. Возьмите пластины с шестью лунками из инкубатора и поместите их под колпак с ламинарным потоком, держа пистолет вертикально прямо над верхней частью пластины с шестью лунками, выстрелите срезом со скоростью 100 фунтов на квадратный дюйм, затем продвинуте ствол вперед и снова очистите его, выстрелив холостым патроном. Снимайте оставшиеся ломтики по одному снимку на ломтик.

После стрельбы верните шесть луночных планшетов в инкубатор и инкубируйте срезы при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух-семи дней с 5% углекислым газом в течение инкубационного периода. Заменяйте среды через день следующим образом, работая под ламинарным вытяжным колпаком, добавляйте новые среды в три незанятые скважины. Затем установите шестилуночную пластину в инкубатор не менее чем на один час, через час верните шестилуночную пластину в ламинарный колпак и с помощью очищенных этанолом изогнутых щипцов переместите каждую сетчатую вставку и ее срез в новую лунку, отасуньте старую среду и верните пластину в инкубатор.

После нескольких дней инкубации срезы теперь готовы к записи целых клеток. Снимите шестилуночную пластину из инкубатора под ламинарный колпак. С помощью изогнутых щипцов, очищенных этанолом, удалите одну сетчатую вставку и ее срез.

Затем установите на место шестилуночную пластину в инкубаторе. Далее перенесите чашку Петри с сетчатой вставкой и разрежьте к области записи, натягивая щипцами или гибким куском металла. Используйте скальпель под номером 11, чтобы срезать сетку вокруг среза, если это необходимо, завершите окончательные разрезы ножницами.

Затем с помощью щипцов перенесите срез и прикрепленную сетку в записывающую камеру. На столике вертикального микроскопа окуните срез в искусственную спинномозговую жидкость, связанную с карбогеном, под оптикой ИК ДВС. Визуализируйте параметаллические нейроны во втором, третьем или пятом слоях под эпифлуоресценцией и фильтром Фитца.

Найдите зеленые трансфицированные клетки с помощью ИК-ДВС-микроскопии. Ищите пули CDNA, которые проявляются в виде маленьких черных точек внутри клеток. Выберите трансфицированную клетку для записи всей клетки.

Затем поднесите микроэлектрод к выбранной ячейке и используйте мягкое всасывание, чтобы получить гигаомное уплотнение. Затем примените дополнительное отсасывание, чтобы проникнуть внутрь клетки для всей клетки. Запись. Теперь ячейка готова к регистрации тока или напряжения на клещах.

На этом рисунке показано флуоресцентное изображение клеток, трансфицированных CDNA для GFP. Следующие записи взяты из клеток, трансфицированных CDNA для GFP. Здесь показан потенциал действия в параметаллической ячейке третьего слоя в ответ на сверхпороговую 10-миллисекундную инжекцию тока.

На этом рисунке показано повторяющееся возбуждение параметаллического нейрона пятого слоя в ответ на двухсекундную инжекцию тока 400 пикоампер. На этом рисунке показана запись зажима напряжения от параметаллического нейрона пятого слоя. Тетродатоксин использовался для блокировки напряжения на стробированном натриевом токе.

Кривые представляют собой внешние калиевые токи, вызванные семейством 500-миллисекундных ступеней напряжения от удерживающего потенциала минус 70 милливольт. После того, как вы овладеете, небольшая подготовка и трансфекция могут быть выполнены примерно за два часа, включая время подготовки. При попытке выполнить эту Процедуру.

Важно поддерживать стерильные условия и ограничивать толщину и размеры ломтика, чтобы предотвратить высыхание. Спасибо за просмотр. Удачи в вашем эксперименте.

Спасибо.