A β غلوكورونيداز (GUS) موت الخلية استنادا الفحص

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام نظام مراسل Gus لتحليل خصائص الموت المحتملة لجينات محددة. يتم استنساخ الجينات المستهدفة في كاسيت Gus وتنميتها في نواقل agrobacterium المناسبة تحت تأثير محفز 35 s. بعد ذلك، يتم تحويل هذه النواقل إلى سلالة Agrobacterium من نوع LBA 44 0 4، وتُخلط مع مستنبت يحتوي على كاسيت تعبير Gus لترشيح أوراق Nick Oceana Hamana.

يمكن تقييم نشاط Gus بصرياً عن طريق الصبغ الكيمياء نسيجي، أو كمياً من خلال مقايسة Fluor metric mug. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل تحليل DNA laddering أو مقايسة tunnel، والتي تشيع استخداماتها في الأنظمة الثديية ولكن يصعب تكرارها في النباتات، في كونها مقايسة عابرة سريعة وحساسة قائمة على النباتات تستفيد من الحقيقة البسيطة المتمثلة في أن الخلايا الحية ضرورية لحدوث تعبير gas. وسيقوم Hua RAOs باستعراض هذا الإجراء اليوم.

يتطلب إجراء الارتشاح، الذي يقوم به باحث ما بعد الدكتوراه في مختبرنا، أوراقاً سليمة ومكتملة النمو لنباتات nicotiana hamana يتراوح عمرها بين ثلاثة إلى ستة أسابيع، والمزروعة عند درجة حرارة 25 °C. خُطط لتنفيذ هذا البروتوكول على مدار ثمانية أيام. في اليوم الأول، يتم تخطيط الأطباق باستخدام مخزونات الجلسرول من agrobacterium tumor fassan التي تحتوي على نواقل مقايسة موت الخلايا والنواقل التي تحتوي على كاسيت تعبير Gus؛ كما يجب دائماً إدراج ناقل فارغ كضابط سلبي أو سدادة (stuffer) عند اختبار تركيبات زرعية متعددة.

يتم تحضين الأطباق عند 28 درجة Celsius لمدة يومين. وفي اليوم الثالث، يتم تلقيح 2 mL من وسط LB الانتقائي بمستعمرة واحدة من كل طبق. ثم يتم تحضين كل مزرعة مع الرج عند 28 درجة Celsius لمدة 24 ساعة بسرعة 200 RPM حتى الوصول إلى أقصى كثافة نمو.

بعد 24 ساعة من التحضين، أعد تعليق المزرعة بالكامل عن طريق الماصة في حال وجود تكتلات، وارفع الحجم الإجمالي لكل مزرعة إلى 10 milliliters باستخدام وسط LB انتقائي طازج لتحفيز جينات الضراوة في agrobacterium. أضف الأسيتون حتى يصل التركيز إلى 25 micromolar، وحضن كل مزرعة مع الرج عند 28 degrees Celsius لمدة 16 ساعة أخرى. الخطوة التالية هي طرد كل مزرعة مركزياً عند 4,000 Gs لمدة 10 minutes في درجة حرارة الغرفة، ثم أعد تعليق الراسب في 10 milliliters من وسط الترشيح.

لا تضف الأسيتون، وقم بطرد المزارع مركزياً مرة أخرى، ولكن الآن قم بإعادة التعليق. علّق كل راسب في خمسة ملليلتر من وسط الارتشاح الذي يحتوي على 100 micromolar من الأسيتون. والآن قم بقياس الكثافة الضوئية OD عند 600 nanometers.

تعتبر التركيزات المنخفضة التي تصل إلى 0.1 مقبولة، ولكن إذا كانت أكبر من 0.9، فيجب التخفيف إلى 0.9 باستخدام وسط التسلل والأسيتون قبل البدء في عملية التسلل. قم بتحضين المزارع مرة أخرى عند 28 درجة مئوية مع الرج لمدة ثلاث ساعات بعد التحضين. اخلط المزارع التجريبية ومزارع التحكم بنسبة واحد إلى واحد مع المزرعة التي تحتوي على كاسيت Gus.

لكل مزرعة، استخدم حقنة سعة 1 mL بدون إبرة لتسريب سدادة ABA أو الجانب السفلي من الأوراق الناشئة حديثاً. إن حجم التسريب ليس مهماً. عندما تتشكل منطقة تشبع مائي، فهذا يعني أنه تمت إضافة كمية كافية؛ عندها قم بتسريب كل من الشاهد السلبي والجين المراد فحصه على أوراق متقابلة في نفس النبتة، ثم كرر عملية التسريب على نبتتين إضافيتين بنفس الطريقة.

وبذلك تتوفر ثلاث نباتات مكررة لكل مستنبت. وبعد مرور ثلاثة أيام على عملية الرشح، يحين وقت جمع الأوراق وفحص تعبير بروتين الغاست. ابدأ التحليل الهيستوكيميائي عن طريق رشح الورقة بأكملها بالتفريغ باستخدام ركيزة xlu حتى يتم تشبعها تماماً.

الآن، يتم تحضين الأوراق في الظلام في درجة حرارة الغرفة طوال الليل أو حتى يظهر تلون أزرق واضح. تُشطف الأوراق بالماء المقطر وتُحضن في إيثانول 70% طوال الليل حتى تتم إزالة الكلوروفيل منها. وفي اليوم التالي، تُشطف الأوراق بالماء المقطر ويتم تقييم مستويات تعبير GUS.

لتقدير كمية تعبير Gus، يتم تحويل الركيزة mug إلى ناتج فلوري mu، والذي يمكن قياسه؛ ابدأ بطحن أقراص الأوراق المرشحة في هاون باستخدام النيتروجين السائل. ثم أضف 100 µL من محلول استخلاص GUS مع الحفاظ على العينة فوق الثلج. الآن قم بطرد المعلق مركزياً عند 14,000 ×g لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C، واجمع الطافي الذي يحتوي على إجمالي البروتينات الذائبة، بما في ذلك Gus.

قم بقياس تركيز البروتين الذائب الكلي باستخدام جهاز NanoDrop واضبط التركيز ليصل إلى 100 micrograms من البروتين الكلي لكل عينة في منظم استخلاص Gus. الآن، أضف ركيزة mug في منظم استخلاص Gus إلى كل عينة ليصل التركيز النهائي إلى two millimolar من mug. سيكون الحجم الإجمالي البالغ 100 microliters لكل عينة كافياً، مع المزج عن طريق الماصة وتحضين التفاعل لمدة ساعة واحدة عند 37 degrees Celsius.

بعد مرور ساعة، يتم إيقاف التفاعل بإضافة 800 µL من محلول GUS stop buffer. ولتقدير كمية GUS، يتم تحميل 100 µL من كل عينة في طبق معايرة دقيق (microtiter plate)، والذي يتم تحليله باستخدام قارئ أطباق فلوري، حيث يتم قياس أطوال موجات الإثارة عند 365 nanometers والانبعاث عند 455 nanometers ومقارنتها بمنحنى قياسي. يمكن بعد ذلك تسجيل نشاط GUS كـ M of mu لكل µg من البروتين القابل للذوبان الكلي لكل دقيقة من التفاعل. يتم الكشف عن مستويات مختلفة من GUS اعتماداً على البنية المستخدمة عندما يتم حقن كاسيت تعبير GUS بالتزامن مع منظم سلبي لموت الخلايا أو جين مضاد للموت.

يُلاحظ وجود مستويات عالية من Gus عند المقارنة. وتكون مستويات Gus في مجموعة التحكم بالناقل الفارغ أقل بكثير. وعلى العكس من ذلك، عند استخدام منظم إيجابي لموت الخلايا أو جين محفز للموت، يُلاحظ انخفاض ملحوظ في تعبير Gus مقارنة بمجموعة التحكم بالناقل الفارغ.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون أسبوع واحد تقريبًا. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر أن هذه التقنية تُستخدم كخطوة أولية لتحديد إمكانيات جينات معينة، إذ يتطلب الأمر إجراء المزيد من العمل لتأكيد هذه النتائج الأولية وتحديد نوع الخلية المعنية.