Name: Vibrodissociation von Neuronen aus Nager Hirnschnitten zu Study Synaptic Transmission and Image präsynaptischen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Lernen Sie die Vibrodissociation von Neuronen aus Nager-Hirnschnitten zur Untersuchung synaptischer Transmission. Diese Methode ermöglicht Patch-Clamp-Aufnahmen und präsynaptische Bildgebung mit verbesserter pharmakologischer Kontrolle.

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Wir möchten Drs anzuerkennen. Ping Jun Zhu und Susumu Koyama für ihre Unterstützung während der ersten bis die Technik gesetzt, und Dr. Veronica Alvarez für die Unterstützung bei der Formatierung der schriftlichen Manuskript. Diese Studie wurde von der Abteilung für Interne Klinische und biomedizinische Forschung von NIAAA finanziert.

<ol><li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+potentiates+gabaergic+synaptic+transmission+in+a+postsynaptic+neuron%2Fsynaptic+bouton+preparation+from+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Ethanol potentiates gabaergic synaptic transmission in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from basolateral amygdala.</a> J Neurophysiol. 96, 433-441 (2006).</li>
<li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+endocannabinoid+signaling+in+a+postsynaptic+neuron%2Fsynaptic+bouton+preparation+from+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Retrograde endocannabinoid signaling in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from basolateral amygdala.</a> J Neurosci. 25, 6199-6207 (2005).</li>
<li>Akaike, N., Moorhouse, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques%3A+Applications+of+the+nerve-bouton+preparation+in+neuropharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Techniques: Applications of the nerve-bouton preparation in neuropharmacology.</a> Trends Pharmacol Sci. 24, 44-47 (2003).</li>
<li>Akaike, N., Murakami, N., Katsurabayashi, S., Jin, Y. H., Imazawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+stimulation+of+single+gabaergic+presynaptic+boutons+on+the+rat+hippocampal+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Focal stimulation of single gabaergic presynaptic boutons on the rat hippocampal neuron.</a> Neurosci Res. 42, 187-195 (2002).</li>
<li>Ye, J. H., Wang, F., Krnjevic, K., Wang, W., Xiong, Z. G., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+glycine+receptors+on+gabaergic+terminals+facilitate+discharge+of+dopaminergic+neurons+in+ventral+tegmental+area%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Presynaptic glycine receptors on gabaergic terminals facilitate discharge of dopaminergic neurons in ventral tegmental area.</a> J Neurosci. 24, 8961-8974 (2004).</li>
<li>Koyama, S., Matsumoto, N., Kubo, C., Akaike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+5-ht3+receptor-mediated+modulation+of+synaptic+gaba+release+in+the+mechanically+dissociated+rat+amygdala+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Presynaptic 5-ht3 receptor-mediated modulation of synaptic gaba release in the mechanically dissociated rat amygdala neurons.</a> J Physiol. 529, 373-383 (2000).</li>
<li>Deng, C., Li, K. Y., Zhou, C., Ye, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+enhances+glutamate+transmission+by+retrograde+dopamine+signaling+in+a+postsynaptic+neuron%2Fsynaptic+bouton+preparation+from+the+ventral+tegmental+area%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Ethanol enhances glutamate transmission by retrograde dopamine signaling in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from the ventral tegmental area.</a> Neuropsychopharmacology. 34, 1233-1244 (2009).</li>
<li>Murakami, N., Ishibashi, H., Katsurabayashi, S., Akaike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+channel+subtypes+on+single+gabaergic+presynaptic+terminal+projecting+to+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Calcium channel subtypes on single gabaergic presynaptic terminal projecting to rat hippocampal neurons.</a> Brain Res. 951, 121-129 (2002).</li>
<li>Zhu, P. J., Lovinger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+synaptic+activity+produces+long-lasting+enhancement+of+endocannabinoid+modulation+and+alters+long-term+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Persistent synaptic activity produces long-lasting enhancement of endocannabinoid modulation and alters long-term synaptic plasticity.</a> J Neurophysiol. 97, 4386-4389 (2007).</li>
<li>Inada, H., Maejima, T., Nakahata, Y., Yamaguchi, J., Nabekura, J., Ishibashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocannabinoids+contribute+to+metabotropic+glutamate+receptor-mediated+inhibition+of+gaba+release+onto+hippocampal+ca3+pyramidal+neurons+in+an+isolated+neuron%2Fbouton+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Endocannabinoids contribute to metabotropic glutamate receptor-mediated inhibition of gaba release onto hippocampal ca3 pyramidal neurons in an isolated neuron/bouton preparation.</a> Neuroscience. 165, 1377-1389 (2010).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+ph-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with ph-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li>
<li>Li, Z., Burrone, J., Tyler, W. J., Hartman, K. N., Albeanu, D. F., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+recycling+studied+in+transgenic+mice+expressing+synaptophluorin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle recycling studied in transgenic mice expressing synaptophluorin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6131-6136 (2005).</li>
</ol>

Erfolgreiche vibrodissociation verlangt, dass Scheiben gesunden Neuronen enthalten und die Zwischenräume sind so flexibel, dass Neuronen, die Scheibe ohne toxische Schädigung zu beenden. So funktioniert die Technik optimal auf frühen postnatalen Alters (P1-21) bei gesunden Scheiben mit weniger Gliazellen / interstiatial Material als bei erwachsenen Hirnschnitten gefunden gemacht werden können. Nach unserer Erfahrung ist jedoch, die Optimierung der Scheibe Vorbereitung auf das neuronale Überleben in der Scheibe selbst als kontraproduktiv für die vibrodissociation Technik kann. Während wir routinemäßig vorzubereiten Scheiben für in-situ-Messung mit kaltem geändert aCSF, in denen Saccharose für einen Großteil der extrazellulären Na + und Ca 2 + ersetzt wurde, Scheiben für vibrodissociation hergestellten kann (z. B. Schnitt) in unserer normalen Aufnahme aCSF werden. Bei der Vorbereitung Scheiben für die Aufnahme von einzelnen Neuronen in den Scheiben selbst legen wir auch Scheiben im normalen aCSF bei 35 ° C kurz nach Schneiden und lassen Sie sie für 30-60 min bei dieser Temperatur, bevor sie dann wieder auf Raumtemperatur. Allerdings sind Scheiben für vibrodissociation vorbereitet sofort auf Raumtemperatur nur nach dem Schneiden bewegt. Diese Verfahren liefern eine höhere Ausbeute an gesunden Neuronen nach vibrodissociation, vielleicht wegen des Mangels an festen interstitiellen Gewebe, das Neuronen leichter geschüttelt werden locker von der Scheibe selbst erlaubt. Wir haben nicht erschöpfend Scheibe Vorbereitung Bedingungen untersucht, wie erhalten wir regelmäßig ausreichend Neuronen für unsere Aufnahme-und Imaging-Experimente an einem bestimmten Tag. Es ist möglich, dass zusätzliche Modifikationen, wie zum Beispiel Änderungen in Schichtdicke oder preincubaton Verfahren gemacht hätte, um die Ausbeute von gesunden Nervenzellen zu erhöhen. Sehr mild Protease-Behandlungen haben in dem Bemühen, die Zelle Ausbeute zu erhöhen und sich die Technik, bei älteren Tieren zu arbeiten versucht. Doch immer noch mild Protease-Behandlung scheint Synapse Funktion zu stören. Während also die Kombination von Protease-und mechanische Dissoziation kann noch gefunden zu arbeiten hat es nicht bewährt bisher in Vorderhirn Neuronen werden. Es sollte auch die relativ geringe Ausbeute von gesunden Neuronen festgestellt werden, nachdem vibrodissociation bedeutet, dass die Technik vor allem zur Untersuchung von reichlich neuronalen Subtypen, vor allem Projektion Neuronen. Die Verfügbarkeit von GFP-exprimierenden Mäusen, bei denen kleine neuronale Subpopulationen leicht identifiziert werden kann, erhöht die Chance, das Studium dieser selteneren Neuronen. Allerdings, es sei denn neuronalen Ertrag verbessert werden kann wesentlich Ansammlung von Daten auf diesen Neuronen ist wahrscheinlich relativ langsam. Mehrere Schritte haben sich als entscheidend für das erfolgreiche Laden von Neuronen mit Calcium-sensitiven Farbstoffen. Die Exposition gegenüber AM-veresterte Farbstoff wird bei 37 ° C durchgeführt, und wir haben bei dem Versuch, Farbstoff-Last bei niedrigeren Temperaturen erfolglos. Die Konzentration der Farbstoffe zu optimieren unter Berücksichtigung sowohl der Ladezeit und der Temperatur, da sie eine höhere Konzentration an Farbstoff-loading senkt Calcium-Konzentration in der präsynaptischen boutons erscheint. Wir haben beobachtet, dass das Laden mit höheren Konzentrationen sinkt die Frequenz und die Amplitude der sIPSCs. Beim Laden von Calcium-sensitiven Farbstoffe in präsynaptischen Endigungen vibrodissociated Neuronen, muss darauf geachtet werden, da die Pufferkapazität des kleinen präsynaptischen boutons kann anders sein als im Soma und die Größen der boutons sind nicht konsistent. Neuron-haltigen Speisen werden mit HEPES-gepufferte externe Lösung folgender Farbstoff-loading gewaschen, und die Recovery-Zeit nach dem Waschen ist entscheidend. Darüber hinaus, um eine gute Abdichtung für whole-cell recording machen, müssen die Zellen gründlich gewaschen werden, um loszuwerden, nicht verinnerlicht Farbstoffmoleküle aus der äußeren Zellmembran. Neben der Verwendung vibrodissociated Neuronen für Elektrophysiologie und Live Cell Imaging, können immunzytochemische Techniken auch für diese Zellen 11,12 angewendet werden. Die Zellen können leicht behoben werden und gefärbt mit einer Vielzahl von Antikörpern und anderen Zell-Markern. Die Verwendung dieser Zellen stellt eine saubere Vorbereitung für die Visualisierung der Proteinexpression in GABAergen präsynaptischen. Mit Mäusen, dass fluoreszierende Proteine ​​exprimieren unter der Kontrolle von Promotoren spezifische GABAerge Neuronen ermöglicht dem Forscher die einzelnen synaptischen Terminals in der die vibrodissociated Vorbereitung (Abbildung 1) zu identifizieren. Imaging Fluoreszenzmarker dieser Art können für die morphologische Messungen in den Terminals mit Hilfe von Laser-basierte Mikroskopie und neuere Techniken wie STED (Stimulation Emission Depletion-Mikroskopie) zu ermöglichen. Visualisierung mit Farbstoffen, die synaptischen Vesikel Radfahren Bericht ist auch mit diesem Präparat möglich. Akaike und Mitarbeiter haben GABAergen Terminals mit der Styryl-Farbstoff, FM1-43 markiert, um Anschlüsse in Wohn Zellen 4 visualisieren. Es sollte auch möglich sein, Single-Cell-Reverse-Transkriptase-PCR zum Profil RNA-Expression führen in vibrodissociatedNeuronen. Diese Technik wird routinemäßig enzymatisch gespalten Neuronen und Neuronen in Zellkultur gezüchtet angewendet.

<table border="1"><tbody><tr><td> Artikel </td><td> Firma </td><td> Catalog # </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Vibrating Tissue Slicer </td><td> Leica Microsystems Inc. </td><td> VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> Zellkulturschale (35 mm) </td><td> BD Falcon </td><td> 353001 </td><td></td></tr><tr><td> Glass Bottom Dishes </td><td> Willco-Gericht </td><td> GWSB-5040 Oder GWSB-3522 </td><td> 0,16-0,19 mm Glasdicke für die Bildgebung </td></tr><tr><td> Piezoelektrische Manipulator </td><td> Exfo-Burleigh </td><td> LSS-3000 </td><td> Könnte auch Relais, etc. </td></tr><tr><td> SD9 Rechteckimpuls Stimulator </td><td> Grass Technologies </td><td> SD9K </td><td> Zur Ansteuerung piezoelektrischer Manipulator </td></tr><tr><td> Dissecting Stereoskop </td><td> Wild Heerbrugg </td><td> TYP 374590 </td><td> Könnte auch jedes Stereoskop </td></tr><tr><td> Flaming / Brown Mikropipette puller </td><td> Sutter Instrument </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Dünnes Glaskapillaren </td><td> World Precision Instruments </td><td> TW-150F-4 </td><td> Für zugeschmolzen Glasmikropipette-und Patch-Mikropipette </td></tr><tr><td> Sechs-Kanal-Perfusion Valve Control System </td><td> Warner Instruments </td><td> VC-6 oder VC-6M </td><td></td></tr><tr><td> Perfusion Fast-Step </td><td> Warner Instruments </td><td> SF-77B </td><td></td></tr><tr><td> Inverses Mikroskop mit 20-63x Ziele </td><td> Nikon </td><td> TS200 Diaphot </td><td></td></tr><tr><td> EMCCD Kamera </td><td> Andor Technology </td><td> iXon EM + DU-888 </td><td></td></tr><tr><td> Excite Fluoreszenz Beleuchtungslichtquelle </td><td> EXFO Photonics Solutions Inc. </td><td> X-Cite 120PC </td><td></td></tr><tr><td> Fluo-4, AM Calcium-Indikator </td><td> Molecular Probes </td><td> F14201 </td><td></td></tr></tbody></table>

vibrodissociation von neuronen aus nager hirnschnitten zu study synaptic transmission and image präsynaptischen

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanische Dissoziation von Neuronen aus dem zentralen Nervensystem hat den Vorteil, dass präsynaptische boutons an der isolierten Neuronen des Interesses bleiben. Dies ermöglicht eine Untersuchung der synaptischen Übertragung unter Bedingungen, wo die extrazelluläre und intrazelluläre postsynaptischen Umgebungen gut kontrolliert werden kann. Eine Schwingung-basierte Technik ohne den Einsatz von Proteasen, wie vibrodissociation bekannt, ist die beliebteste Methode zur mechanischen Isolation. Eine Mikropipette, mit der Spitze feuerpolierte, um die Form einer kleinen Kugel, in einen Hirnschnitt aus einem P1-P21 Nagetier gemacht platziert. Die Mikropipette wird parallel zur Schnittfläche vibrierte und senkte durch die Schichtdicke sich in der Befreiung des isolierten Neuronen. Die isolierten Neuronen sind bereit für das Studium innerhalb von wenigen Minuten von vibrodissociation. Diese Technik hat Vorteile gegenüber der Verwendung von primären neuronalen Kulturen, Hirnschnitten und enzymatisch isolierten Neuronen ua: schnelle Produktion von lebensfähigen, relativ ausgereifte Neuronen für elektrophysiologische und bildgebende Verfahren; bessere Kontrolle der extrazellulären Umgebung frei von den Einflüssen der benachbarten Zellen; Eignung für gut kontrollierte pharmakologische Experimente mit schnellen Drug Application und insgesamt Zelle Superfusion und verbesserten Raum-Klemme in Ganzzellableitungen relativ zu Neuronen in Scheiben oder Zellkultur Vorbereitungen. Dieses Präparat kann zur synaptischen Physiologie, Pharmakologie, Modulation und Plastizität zu untersuchen. Real-time Bildgebung sowohl prä-und postsynaptischen Elemente in den lebenden Zellen und boutons ist auch mit vibrodissociated Neuronen. Charakterisierung der molekularen Bestandteile von prä-und postsynaptischen Elemente können auch mit immunologischen und Imaging-basierte Ansätze erreicht werden.

Dieser Bericht zeigt eine Technik zur mechanischen Isolation von einzelnen Neuronen lebensfähig halten befestigt präsynaptischen boutons. Vibrodissociated Neuronen haben die Vorteile der schnellen Produktion, ausgezeichnete pharmakologische Kontrolle und verbesserten Raum-Klemme, ohne Einfluss von benachbarten Zellen. Diese Methode kann für die Bildgebung der synaptischen Elementen und Patch-Clamp-Aufzeichnung verwendet werden.

Vibrodissociation von Neuronen aus Nager Hirnschnitten zu Study Synaptic Transmission and Image präsynaptischen

Die mechanische Dissoziation von Neuronen aus dem zentralen Nervensystem hat den Vorteil, dass presynaptische Boutons an dem isolierten Neuron von ... befestigt bleiben.

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Neuronen zu isolieren, die angeheftete, abgeschnürte synaptische Batons behalten, wodurch eine pharmakologische Kontrolle und eine verbesserte räumliche Abschirmung ermöglicht werden, während gleichzeitig der Einfluss benachbarter Zellen eliminiert wird. Dies wird erreicht, indem akute Gehirnschnitte von Ratten oder Mäusen vom postnatalen Tag P1 bis P21, die das gewünschte Gehirnareal enthalten, hergestellt werden, um im zweiten Schritt einzelne Neuronen zu isolieren. Die akuten Schnitte werden in eine Schale gegeben, und eine flammversiegelte Glas-Mikropipette wird im Bereich des Interesses vibriert, während die Spitze durch den Schnitt bewegt wird, wodurch einzelne Neuronen freigesetzt werden.Den Neuronen wird Zeit gegeben, sich am Boden der Petrischale anzulagern. Anschließend wird die Schale mit den fibro-dissociierten Neuronen unter ein Mikroskop gebracht, um die synaptische Physiologie, Pharmakologie, Modulation, Plastizität sowie Echtzeit-Bildgebung und Charakterisierung prä- und postsynaptischer Elemente in lebenden Zellen zu untersuchen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen die physiologischen und pharmakologischen Eigenschaften synaptischer Antworten sowie assoziierte Veränderungen der präsynaptischen Terminalfunktion mittels Tight-Seal-Whole-Cell-Aufzeichnung und Fluoreszenzmikroskopie. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Ableitung aus Gehirnschnitten, kultivierten Neuronen oder enzymatisch dissociierten Neuronen besteht darin, dass die angeheftete, robuste synaptische Verbindung die Kontrolle und Visualisierung präsynaptischer Elemente ermöglicht, während die relativ kompakte postsynaptische Struktur eine verbesserte Spannungsclampung und hervorragende Kontrolle über die extrazelluläre Umgebung erlaubt.Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da die Ausbeute an gesunden Neuronen stark variieren kann, abhängig von mehreren Bedingungen wie dem Alter des Tieres, den Vibrationsparametern und dem interessierenden Bereich im Schnitt. Außerdem halten Zellaufzeichnungen kürzer an als bei herkömmlichen Präparaten. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte der VI-Dissociation schwer zu erlernen sind, weil die Bewegungsstrecke und das Eindringen durch den Schnitt schwer genau zu beschreiben sind. Zur Vorbereitung der Herstellung der Gehirnschnitte bereiten Sie künstlichen zerebralen Spinalflüssigkeit, die 15 Minuten mit Carbogen durchblubbert wird (aCSF), vor.Fügen Sie anschließend zwei Millimolar Calciumchlorid und ein Millimolar Magnesiumchlorid hinzu. Nach der Anästhesie und Enthauptung eines Tieres im postnatalen Alter von P1 bis 21 entfernen Sie das Gehirn und schneiden es in der gewünschten Orientierung, sodass die Region von Interesse enthalten ist. Befestigen Sie das präparierte Gehirn an einer Halterung und tauchen Sie es in eine mit aCSF gefüllte Kammer ein.Danach die Kammer auf einen Gehirnschneider montieren und das Gehirn mit einer vibrierenden Klinge in Schnitte von 250 bis 400 Mikrometer Dicke pro Schnitt schneiden. Die Schnitte in ein ACSF geben und mindestens eine Stunde lang in einer Vorinkubationskammer mit Carbogen durchblubbern. Um eine flammversiegelte Glas-Mikropipette herzustellen, zunächst eine Standard-Patch-Clamp-Mikropipette mit einem Tip-Durchmesser von zwei Mikrometern auf einem Flaming-Brown- oder gleichwertigen Mikropipettenzieher ziehen.Platzieren Sie die Mikropipettenspitze etwa zwei Sekunden lang in die Flamme eines Bunsenbrenners, um eine geschmolzene Kugel mit einem Durchmesser von 200 bis 300 Mikrometern zu bilden. Danach befestigen Sie die flammengeschlossene Patch-Pipette an einem Halter des Mikromanipulators, der seitlich mit einer Wegstrecke von 100 bis 200 Mikrometern schnell vibriert werden kann, mithilfe eines piezoelektrischen Bimorph-Relais oder eines gleichwertig wirksamen Geräts. Bereiten Sie gepufferte Salzlösung vor.Stellen Sie den pH-Wert der Lösung mit Natriumhydroxid auf 7,4 ein und die Osmolarität mit Saccharose auf etwa 300 Milliosmol. Füllen Sie dann eine Kulturschale mit 35 Millimeter Durchmesser mit der gepufferten Salzlösung. Legen Sie eine Schnittprobe in die Kulturschale und betrachten Sie sie mit einem Stereomikroskop bei 250-facher Vergrößerung mithilfe eines gebogenen Drahts.Halten Sie die Schnittprobe am Boden der Schale, um die Zellen zu dissoziieren. Positionieren Sie die an der Flamme versiegelte Mikropipettenspitze auf der Oberfläche der Schnittprobe. Aktivieren Sie den Mikromanipulator, sodass die Spitze lateral mit 10 bis 30 Hertz und einer Hubweite von etwa 100 Mikrometern vibriert.Senken Sie die Mikropipettenspitze mithilfe des Mikromanipulators in das Schnittpräparat, sodass sie innerhalb von 30 Sekunden die gesamte Dicke durchschneidet. Wiederholen Sie diesen Schritt nach Bedarf, um die Anzahl der isolierten Neuronen zu maximieren. Entfernen Sie anschließend die Spitze aus dem Schnittpräparat.Nehmen Sie die Schnittprobe mit einer Pinzette auf und schütteln Sie sie vorsichtig in der Lösung. Anschließend entfernen Sie die Schnittprobe vollständig aus der Lösung. Lassen Sie die Zellen mindestens 10 Minuten lang auf den Boden der Petrischale sedimentieren.Platzieren Sie die Schale mit den Neuronen auf dem Objekttisch eines invertierten Mikroskops und betrachten Sie sie mit einem Objektiv von 1x bis 63x. Suchen Sie nach Neuronen mit glatten Membranen ohne Blasenbildung und erkennbaren, aber nicht übermäßig großen Kernen. Falls Phasenkontrastoptik verwendet wird, achten Sie auf phasenhelle Neuronen mit einer gelblichen Färbung, jedoch nicht zu bläulich.Ziehen Sie eine Standard-Patch-Mikropipette mit einem Flaming-Brown-Pipettenzieher oder einem vergleichbaren Gerät, sodass der Elektrische Widerstand der Pipettenspitze zwischen zwei und vier Megaohm liegt. Füllen Sie die Patch-Pipette mit einer auf Cäsiumchlorid basierenden intrazellulären Lösung zur Messung synaptischer Antworten oder mit einer auf Kaliumchlorid basierenden intrazellulären Lösung zur Messung intrinsischer Membraneigenschaften und Aktionspotentiale. Führen Sie die Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahme an dem Neuron unter Verwendung standardmäßiger elektrophysiologischer Techniken durch.Notieren Sie zunächst spontane postsynaptische Ströme mithilfe eines lückenlosen Datenakquisitionsprotokolls. Anschließend geben Sie 200 Nan Tiere oder Tetrodotoxin und/oder eine kalziumarme extrazelluläre Lösung zu, um miniaturisierte postsynaptische Ströme aufzuzeichnen, um den extrazellulären molekularen Gehalt zu verändern. Wirkstoffe werden einzeln in einen der Schenkel eines verschmolzenen, quadratisch abgeschliffenen Glasrohrs geladen, das in der Nähe des betreffenden Neurons positioniert wird.Ein einzelnes Barrel wird durch einen Schrittmotor-gesteuerten Mikromanipulator, der sich seitlich bewegt, um einen Lösungswechsel innerhalb von 10 bis 100 Millisekunden zu ermöglichen, dem Neuron ausgesetzt. Untersuchen Sie die heruntergeladenen bns mit hoher Vergrößerung und einem Objektiv mit hoher numerischer Apertur in einem kamerabasierten oder Multiphotonen-Mikroskop. Gezeigt ist hier das Bild eines Neurons und der bns, aufgenommen mit einer elektronenvervielfachenden CCD-Kamera.Die Leistung der Lichtquelle für die Anregung wurde während der Spannungs-klemm-Aufnahmen mit einem Neutraldichtefilter mit Dichte 1,0 und einem auf 12 % Ausgangsleistung eingestellten Irisfilter auf 1,2 % abgeschwächt. Mit einer auf Cäsiumchlorid basierenden intrazellulären Lösung werden spontane synaptische Ströme beobachtet, um die vesikuläre Fusion zu visualisieren. In den präsynaptischen Batons haben wir Mäuse verwendet, die den synaptischen Florin-Konstrukt unter der Kontrolle des TH1-Promotors exprimieren.Synaptischer Florin ist ein molekularer Konstrukt, bei dem eklipsierendes Florin, ein GFP-Mutant mit erhöhter pH-Sensitivität, an das vesikulär assoziierte Membranprotein gekoppelt ist, das nach der Vesikel-Fusion freigelegt wird. Dieses Motiv wird der neutraleren extrazellulären Umgebung ausgesetzt, was zu einer Zunahme der Fluoreszenz an Pünktchen führt, die Vesikeln und präsynaptischen Endigungen entsprechen. Die Fibrillendissoziation von hippokampalen Neuronen aus diesen Mäusen ermöglicht es, fluoreszierende Pünktchen in der Größe und Lage zu visualisieren, wie sie für GABAerge Endigungen erwartet werden, während dieses Verfahrens.Es ist wichtig zu bedenken, dass gesunde Neuronen nur vorliegen, wenn auch die Schnitte gesund sind. Daher ist die Herstellung akuter Gehirnschnitte ein entscheidender Schritt in diesem Verfahren. Nach Abschluss dieses Verfahrens können weitere Methoden wie Immunhistochemie oder Einzelzell-Echtzeit-PCR angewendet werden, um zusätzliche Fragestellungen zu klären, beispielsweise welche Proteine und mRNA-Spezies in den synaptischen Knöpfchen oder postsynaptischen Neuronen exprimiert werden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man gesunde isolierte Neuronen gewinnt und für die Elektrophysiologie sowie die Echtzeit-Bildgebung verwendet.

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Forschung

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Neurowissenschaften

Wir demonstrieren den Einsatz der Gen-Kanone, um fluoreszierende Farbstoffe, wie DII, zu Neuronen in Hirnschnitten von Nagern und Primaten verschiedener Altersstufen einzuführen. In diesem speziellen Fall, verwenden wir erwachsenen Mäusen (3-6 Monate alt) und Erwachsenen cynomologus Affen (9-15 Jahre alt). Diese Technik, die ursprünglich von dem Labor von Dr. Lichtman beschrieben...

DiOLISTIC Labeling von Neuronen aus Nager und nicht-menschlichen Primaten Hirnschnitten

Das Video beschreibt die elektrophysiologische Aufzeichnung von Retinogenikulat- und Kortikogenikulat-Synapsen in Hirnschnitten von Mäusen. Die Schnitte, die den dorsalen lateralen Nucleus geniculatus (dLGN) enthalten, werden in eine Aufnahmekammer gelegt. Eine stimulierende Pipette wird entweder auf dem Sehtrakt positioniert, um retinale Ganglienzellen (RGCs) zu stimulieren und retinogenikulate Synapsen zu untersuchen, oder auf dem Nucleus reticularis thalami, um kortikale Neuronen zu...

Eine elektrophysiologische Studie von Retinogenikulat- und Kortikogenikulat-Synapsen in Hirnschnitten von Mäusen

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Untersuchung der synaptischen Effizienz im lateralen entorhinalen Kortex (LEC) durch optogenetische Stimulation der medialen präfrontalen Kortex (mPFC) Axone und Aufzeichnung der Reaktionen von Pyramidenneuronen im LEC. Diese Methode kombiniert Patch-Clamp-Aufzeichnungen mit synaptischer Aktivierung durch Lichtstimulation, um die synaptische Plastizität zu untersuchen.

Optogenetische Stimulation und elektrophysiologische Aufzeichnung synaptischer Ereignisse in Hirnschnitten von Ratten

Quelle: McLeod, F., et al. Bewertung der Synapsendichte in Hirnschnitten von Hippocampus-Nagetieren. J. Vis. exp. (2017). Dieses Video demonstriert eine Methode zur Visualisierung synaptischer Marker in hippokampalen Hirnschnitten mittels konfokaler Immunfluoreszenzanalyse. Die Scheiben werden mit primären Antikörpern immungefärbt, die auf präsynaptische und postsynaptische Marker abzielen, gefolgt von Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern. Die markierten Marker werden dann mit Hilfe der...

Mikroskopische Analyse von Synapsen in Hippocampusschnitten der Maus mittels Immunfluoreszenz

Die Aufzeichnung von Ca2+-Strömen an der präsynaptischen Freisetzungsgesichtsmembran ist der Schlüssel zu einem präzisen Verständnis des Ca2+-Eintritts und der Neurotransmitterfreisetzung. Wir präsentieren eine akute Dissoziation des Neunauge-Rückenmarks, die funktionelle isolierte retikulospinale Axone liefert, die eine Aufzeichnung direkt von der Freisetzungsgesichtsmembran einzelner präsynaptischer Endungen ermöglichen.

Akute Dissoziation von Neunauge retikulospinale Axone in den Aufnahme von der Trennfläche Membran einzelner Funktions präsynaptischen aktivieren

Patch-Clamp-Aufzeichnungen und gleichzeitige intrazelluläre Biocytin-Füllung von synaptisch gekoppelten Neuronen in akuten Hirnschnitten ermöglichen eine korrelierte Analyse ihrer strukturellen und funktionellen Eigenschaften. Ziel dieses Protokolls ist es, die wesentlichen technischen Schritte der elektrophysiologischen Aufzeichnung von neuronalen Mikroschaltkreisen und deren anschließende morphologische Analyse zu beschreiben.

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Ein Protokoll für die präzise Identifizierung und Analyse von Synapsen im Hippokampus Scheiben mit Immunfluoreszenz ist in diesem Artikel beschrieben.

Bewertung der Synapse Dichte im Hippokampus Nagetier Gehirnscheiben

Wir präsentieren Ihnen eine Methode, die Kombination von ganzen Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen und zwei-Photon imaging um Ca2 + Transienten im neuronalen Dendriten in akuten Hirnschnitten zu erfassen.

Zwei-Photonen-Kalzium Imaging in neuronalen Dendriten in Hirnschnitten

Wir beschreiben Verfahren zur Verarbeitung von Neugeborenen-Ratten-Hirngewebe, um hochauflösende Elektronenmikrogramme für die morphometrische Analyse der synaptischen Vesikelverteilung an Nerventerminals zu erhalten. Die mit diesen Methoden gewonnenen Mikrographen können auch verwendet werden, um die Morphologie einer Reihe anderer zellulärer Komponenten und deren dimensionale strukturelle Zusammenhänge zu untersuchen.

Vorbereitung des Neugeborenen Ratsprofels für die ultrastrukturelle Morphometrische Analyse der Verbreitung synaptischer Bläschen an Nerven-Terminals

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die virale Transduktion diskreter Hirnregionen mit optogenetischen Konstrukten beschreibt, um eine synapsenspezifische elektrophysiologische Charakterisierung in akuten Nagetierhirnschnitten zu ermöglichen.

Ex vivo Optogenetische Befragung der synaptischen Übertragung und Plastizität über große Entfernungen vom medialen präfrontalen Kortex zum lateralen entohinalen Kortex

Dieses Protokoll stellt eine robuste, detaillierte Methode dar, um hochreine Synaptosomen, synaptische Vesikel und andere synaptische Fraktionen aus dem Mausgehirn zu erhalten. Diese Methode ermöglicht die Bewertung synaptischer Prozesse, einschließlich der biochemischen Analyse der Proteinlokalisation und -funktion mit kompartimentärer Auflösung.

Subzelluläre Fraktionierung zur Isolierung synaptischer Komponenten aus dem murinen Gehirn

Lernen Sie die Vibrodissociation von Neuronen aus Nager-Hirnschnitten zur Untersuchung synaptischer Transmission. Diese Methode ermöglicht Patch-Clamp-Aufnahmen und präsynaptische Bildgebung mit verbesserter pharmakologischer Kontrolle.

Vibrodissociation von Neuronen aus Nager Hirnschnitten zu Study Synaptic Transmission and Image präsynaptischen

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