Name: 구강 편평 세포 암종의 Orthotopic 마우스 모델에서 종양 세포 침략의 다중 광자 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 배우세요 구강 편평 세포 암종의 orthotopic 마우스 모델에서 다중 광자 현미경을 이용한 종양 세포 침략의 3차원 시각화 및 정량화 방법을. 이 기술은 항침략 화합물 평가에 활용됩니다.

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NIH 교부금 P20 RR16440의 하위 연구 및 대학원 교육의 웨스트 버지니아 대학 사무실에서 S. 비드에 다리 부여 지원. 프로젝트 개발의 초기 단계 동안 L. 로페즈 - 스키너의 기술 지원은 기꺼이 인정받고 있습니다. P. 터너와 K. 시크 레스트 (웨스트 버지니아 대학학과, 저자는 또한 기술 지원 및 J. 마이어와 M. Younes (머리와 목은 외과학과, MD 앤더슨 암 센터, 휴스턴, TX)에서 OSC19 세포에 대한 감사 histological 처리 절차에 대한 병리 조직 은행), pLL7.0 lentiviral 벡터에 대한 LifeAct - mCherry 구조 J. 베어 (노스캐롤라이나 대학)에 대한 R. Wysolmerski (웨스트 버지니아 대학 신경 생물학과 해부학의학과). 웨스트 버지니아 대학 현미경 이미징 시설의 사용 (NIH 부여 P20 RR16440와 메리 밥 랜돌프 암 센터 지원) 및 비선형 광학 현미경 실험실 (NLOM, 공동 신경 과학을위한 웨스트 버지니아 대학 센터 간의 협력과 지원 물리 / 웨스트 버지니아 Nanoscience 이니셔티브의 웨스트 버지니아 대학학과)도 기꺼이 인정받고 있습니다. NLOM은 신경 과학을위한 센터에 NIH 부여 P30 RR031155에 의해 부분적으로 지원됩니다.

1. 셀 라인, 벡터 건설과 Lentiviral 제작 <ol><li> 인간의 머리와 목의 종양 세포 라인 (OSC19 또는 UMSCC1) 10 % 태아 소 혈청 FBS (Hyclone 고양이 # SH30070.03), 1 % 페니실린과 보충 (Cellgro 고양이 # 50-003 - PB) DMEM으로 구성된 완벽한 매체 교양되었습니다 / 스트렙토 마이신 (Cellgro 고양이 # 30-002 - CI), 1 %가 아닌 필수 아미노산 (Cellgro 고양이 # 25-025 - CI). </li><li> pLL7.0 lentiviral 벡터로 LifeAct - mCherry 코딩 순서를 전송하기 위해 cDNA 부모 mCherry에 Sbf1 인식 사이트는 사이트 이동 돌연변이 유발 (Stratagene 고양이 # 200518-5)를 사용하여 인식 순서로 3 자동 변이를 도입함으로써 변경되었습니다. 그 결과 수정된 LifeAct - mCherry 순서는 다음 PCR은 EcoR1/Sbf1 사이트를 측면과 증폭 및 pLL7.0 - LifeAct - mCherry 구조를 생성하는 pLL7.0에 subcloned되었습니다. </li></ol> 2. pLL7.0 - LifeAct - mCherry 바이러스 생산 <ol><li> 바이러스성 생산은 Lentiviral 표현 시스템 매뉴얼 (시스템 Bioscience 버전 2-051018)에 따라 실시되었다. </li><li> 포장 세포주 293T/17 세포 (ATCC 고양이 # CRL - 11268) HNSCC 라인에 사용된 것과 같은 완전한 미디어 40 % 합류로 성장했다. </li><li> 전지는 각각 (Clontech 고양이 # 631312) CalPhos를 사용하여 pLL7.0 - LifeAct - mCherry, psPAX2 및 3시 2분 1초 비율 pVSV - G 벡터와 transfected되었습니다. </li><li> 24 시간 후에, transfection의 초기 미디어가 새로운 미디어로 대체되었습니다. </li><li> 미디어 다음 수집 보충함 매 12 시간 72 시간 4 ° C.에 저장된 </li></ol> 3. 안정 LifeAct - mCherry의 표정으로 머리와 목은 세포 라인의 생산 <ol><li> 수집된 미디어 4 10 분 2,000 RPM에서 건지 알고 있느냐 ° C. </li><li> 바이러스를 포함한 명확히 미디어 중 하나 ML 직접 12 시간 OSC19 또는 UMSCC1 세포에 추가되었습니다. 전지는 다음 씻어서되었고, 바이러스의 추가 한 ML은 다른 12 시간 동안 추가되었습니다. </li><li> 세포는 강한 식민지를 선택하는 두 주 동안 200mg/ml puromycin를 포함하는 매체와 치료를했다. </li><li> 살아남은 클론은 형광 현미경으로 LifeAct - mCherry 표현에 대한 시각 상영되었다. 개인 긍정적인 식민지는 무균 3mm 복제 디스크 (피셔 고양이 # 0790710A)를 사용 typsinized되었습니다. </li><li> 긍정적인 세포는 다시 냉동 또는 orthotopic 사출에 사용까지 200mg/ml puromycin를 포함하는 미디어를 유지했다. </li></ol> 4. Orthotopic 종양 이종 이식의 형성 <ol><li> 모든 동물의 절차는 웨스트 버지니아 대학 동물 케어 및 사용위원회의 승인을 프로토콜 (09-0821)에 따라 실시되었다. </li><li> LifeAct - mCherry 표현 종양 세포는 trypsinized centrifuged 및 2.5 X 10 4 세포를 50 μL 전체 미디어 resuspended 하였다. </li><li> 종양 세포는 27에 연결된 한 ML 주사기 ½ 바늘에로드되었습니다. </li><li> 여성 athymic Fox1 뉴 / 뉴 생쥐 연령 8 주 (할란 연구소)는 마취제와 10mg/kg xylazine을 80mg/kg의 조합 anesthetized되었습니다. Anesthetized 생쥐는 가열 패드에 37-40 ° C 사이에서 유지되었다. </li><li> 멸균 집게를 사용하여 혀끝을 부드럽게 쥐었다 조심스럽게 구강 밖으로 뽑았습니다. </li><li> 세포 천천히 언어 동맥을 피하기 위해, 혀 중앙에 주먹코 미사를 만드는 각각의 혀가 한쪽으로 주입되었다. </li><li> 마우스는 2.1mg/kg의 최음제 (요힘빈)와 함께 주입하고 그들이 마취에서 회복하는 동안 2~3시간에 대한 모니터링했던 손난로으로 반환되었습니다. </li><li> 일단 부흥, 생쥐는 유전자 변형 부드러운 반죽 다이어트 (Bioserve 고양이 # S3472)이있는 무균 새장에 배치했다. </li><li> 생쥐 2-3일 모든 무게와 종양 발병에 대한 시각 감시했다. </li></ol> 5. 전 생체내 이미징을위한 마우스 방언의 준비 <ol><li> 다른 시간 지점 (일반적으로 2~4주 후 주사)에 종양을 품고 마우스는 이산화탄소 흡입에 의해 euthanized되었다. </li><li> 방언은 추출 1X PBS로 씻어서 현지 취미 상점과 크기 8 바느질 바늘에서 monofilament의 바느질 스레드를 사용하여 기존의 파라핀 조직 포함 카세트의 한쪽 (StatLab 캣 # H104)에 붙어 있었다. </li><li> 방언이 고정화되었다되면 전체 카세트 어셈블리는 30mm 조직 문화 요리에 위치하고 1X PBS에 열중했다. </li><li> 가공 방언은 즉시 두 광자 여기 현미경에 사용되었습니다. </li></ol> 6. 두 광자 현미경과 혀 종양의 영상 <ol><li> 텅 카세트는 직립 현미경 (; 서터 악기 움직일 수있는 현미경 (MOM))의 목적에 따라 위치 개폐식 캔틸레버 암 (상공 회의소 셔틀, 시스키유 악기)에 맞춤 설계된 소지자의 보안 1X PBS를 포함 60mm 접시에 빠져들되었다. </li><li> 40X/0.8NA 물 수영 객관 렌즈는 가시 텀에 이상 직접 배치했다또는 병변. 사파이어 레이저 (미라, 일관된) 60 MW와 755 nm의 파장의 입력에서 강도 mCherry 신호를 최적화하기 : 방언은 티로 두 광자 현미경으로 몇 군데 있었다. </li><li> 시리얼 1mm 레이저 스캔 이미지 15 및 100 μm의 (종양 부피에 따라) 사이의 전체 조직이 깊이 대 1 μm의 증분 깊이에서 수집된 있었다. 이미지 ScanImage, 카렐 스보보다 실험실 (Janelia 팜, HHMI)에 의해 개발된 MATLAB 플랫폼을 기반으로 오픈 소스 프로그램을 사용하여 점령했다. ScanImage는 X / Y 갈바 스캔 미러를 제어하는​​ 래스터 스캔 패턴의 2 채널 출력을 생성하고, 동시에 (PCI - 6610S 데이터 수집 보드를 통해 photomultiplier 튜브 (PMTs)에서 동시에 최대 4 채널의 신호 입력을 캡처 , 내쇼날 인스 트루먼 트). PMT 신호는 모니터 화면에 표시를위한 NI - DAQ 보드에 이송하기 전에 저소음 현재 preamplifiers (SR570, 스탠포드 연구 시스템)에 의해 증폭됩니다. ScanImage은 목표의 Z 축 제어를하여 Z - 스택 이미지를 수집하고 단일 또는 사이클 모드에서 시간 경과 이미지를 수집합니다. 이미지는 16 비트 깊이로 단일 TIFF 파일에 저장되었습니다. </li></ol> 7. Amira 소프트웨어를 사용하여 이미지 분석 <ol><li> 종양 부량에 대한 Amira 이미징 : Aimra 소프트웨어에서 Z - 스택 이미지의 집합을 포함하는 TIFF 파일을 엽니다. </li><li> 파일 이름을 강조 표시, 선택하고 입체 렌더링을 생성하는 Voltex 기능을 적용할 수 있습니다. 이하 침략 세포의 여러 작은, dissociated 침해 그룹 (IG)와 큰 차 종양 이미지 (그림 6A 참조) 렌더링된 이미지에 일반적으로 분명합니다. </li><li> 기본 종양의 질량을 선택하려면 다음 다음 "레이블 필드를" "레이블", "오픈 데이터"를 선택하십시오. </li><li> 기본 Thresholding 모든 Z - 스택 이미지를 종양 것은의 선택과 세 차원에서만 기본 종양의 질량 포함을 보장하기 위해 Z - 비행기의 이미지를 스크롤합니다. 이것은 일반적으로 현장에서 가장 큰 크기의 이미지와 몇 군데가 Z - 비행기를 통해 통과와 같이 자주 세그먼트가 나타납니다. </li><li> 배경 형광을 수정하고 폐기 종양 신호의없이 이미지에서 그것을 제거하는 마술 지팡이 / 임계값 기능을 사용하십시오. "내부 파일"레이블을 강조 표시하고 ⊕ 버튼을 클릭합니다. "모든 조각"확인란을 선택합니다. 이것은 모든 Z - 스택 증가에 thresholded 기본 종양 주변 색 테두리를 생산하고 있습니다. </li><li> IGS를 선택하려면, "새"기능을 선택합니다. 단일 IG을 선택하고 그것이 Z - 비행기 스크롤하여 기본 종양과 관련되지 않도록. </li><li> "모든 조각"을 선택하고 ⊕ 버튼을 클릭합니다. 파일 (IG 1 예)을 이름 바꾸기 </li><li> 7.4에서 thresholding 절차를 반복하여 결정 IG에 대해 7.5의 하이라이트 단계. 기본 종양의 질량을 나타내는 데 사용되는 색상과 다를 외곽선 색상을 선택합니다. </li><li> 모든 IGS가 표시됨 수 있도록하는 Z - 비행기를 통해 스캐닝, 이미지를 통해 각 추가 IG에 대해 필요한 반복합니다. 이미지를 미래의 식별에있는 각 식별 IG 에이즈에 대해 서로 다른 색상을 사용합니다. </li><li> 기본 종양 모든 IGS이 선택되면, 풀다운 메뉴에서 "분할"을 선택 후, '물질 통계 "를 선택하십시오. 이것은 볼륨의 측정뿐만 아니라 X, Y 및 X 종양 코어는 중앙 종양 지점에서 IGS의 거리를 계산하기 위해 기본 종양에 대한 좌표를 제공합니다. </li><li> 볼륨 계산을 통해 기본 종양의 중심 코어에서 각 IG에 대한 거리를 결정합니다. 다음 '세그먼트', '자재 통계 "를 선택하십시오. 이 단계는 픽셀로 모든 측정을 계산합니다. 현미경 목표의 교정과 배율에 추가 증가 (; 줌 기능 IE)를 기반으로 micrometers에 픽셀을 변환합니다. 현미경 이러한 실험에 사용되는 설정에, 40X 목표는 1 픽셀 = 0.298 μm의의 교정을 제공, 아니 확대와 함께 사용되었다. 3 차원에 기본 종양 (X1, Y1, Z1) 및 각 IG (X2, Y2, 첫 번째 IG에 대한 Z2 예)에 대한 매개 변수를 제공 Excel 스프레드 시트로 가져오기 데이터입니다. </li><li> 기본 종양의 중심에서 각 IG에 대한 미크론의 침략 거리는 공식 √ ((X2 - X1) 2 +를 (Y2 - Y1) 2 + (Z2 - Z1) 2)를 사용하여 계산됩니다. </li><li> 종양 침입 색인 (T I) 수식 T I = N T X V T X D T, N T = 이미지에 IGS의 총 개수, V T = 모든 IGS의 총 볼륨, D T를 사용하여 계산됩니다 = 총 거리는 기본 종양의 중심에서 모든 침략적 그룹 여행. </li></ol> 8. 니콘 NIS - 요소 소프트웨어와 입체 렌더링 <ol><li> 큰 지형 세부 사항과 함께 입체 렌더링은 니콘 NIS - 요소 소프트웨어로 전체 종양 이미지의 원본 16 비트 흑백 TIFF 파일을 가져와서 생성할 수 있습니다패키지 (니콘, 멜빌, NY). 다음 "ND"를 "파일"을 선택한 다음 "파일 시퀀스에서 ND 파일 만들기". TIFF Z - 시리즈 이미지 스택을 선택하고 해당 단계의 크기를 지정합니다. </li><li> XY 평면에서 ND 문서를 보정합니다. 수동 보정을 사용하여 한 픽셀의 크기를 지정합니다. </li><li> "볼륨보기"를 선택합니다. 높은 품질 Z - 비행기에 추가 조각을 계산하려면 "HQ"기능을 사용하십시오. "3D 렌더기 설정"에서 "초고 세부 사항"과 "전체 해상도"의 품질 "고급 렌더기"를 사용합니다. 종양 표면을 강조하기 위해 '알파 블렌딩 "을 선택합니다. </li><li> 프레 젠 테이션에 대한 3 차원 이미지를 최적화합니다. 종양 및 관련 IGS하며 필요에 따라 작물에 확대. XYZ의 비행기에서 이미지를 회전하고 LUTs를 조정합니다. </li><li> 프레 젠 테이션에 대한 이미지를 캡처합니다. "편집 - 만들기보기 스냅샷 (8 비트 RGB)"를 선택하십시오. 이름과 그에 따라 파일을 저장합니다. </li></ol> 9. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig1.jpg" alt="그림 1"> 그림 1. orthotopic 혀 종양 생산과 현장이 광자 이미징의 주요 단계를 설명하는 전체 설계도. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig2.jpg" alt="그림 2"> 그림 2. 마우스 혀를에 OSC19 세포를 표현 LifeAct - mCherry의 사출. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig3.jpg" alt="그림 3"> 그림 3 Resected 종양 함유 마우스 혀가 두 광자 이미징을위한 준비. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig4.jpg" alt="그림 4"> 그림 4. 이미징 준비 두 광자 현미경의 위치에 종양이 함유 혀가의 오리 엔테이션. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig5.jpg" alt="그림 5"> 그림 5. ScanImage은 초기 두 광자 이미지의 원시 데이터 수집을 보여주 쏜 대표 화면. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig6.jpg" alt="그림 6"> 그림 6. orthotopic OSC19 종양의 이미지 분석 및 종양 침략의 부량. Amira Voltex 렌더링 (A)와 하나의 thresholded Z - 섹션 대표 스크린샷 이미지가 (B) 기본 기본 종양과 파란색으로 설명 자주색, 침략 그룹 1 (IG - 1)에 명시된, IG - 2는 빨간색 IG에 명시된 -3는 식별 절차의 예를 들어 녹색으로 설명했다. 화살촉이에 IGS을 나타냅니다 (A)와 (B). 볼륨 C. 플로츠 대 종양 침공 지수 (TI)를 계산하는 데 사용 여덟 개인 IGS에 대한 거리를 침공. <img src="/files/ftp_upload/2941/2941fig7.jpg" alt="그림 7"> 그림 7. 대표 종양의 이미지 및 기존 IHC 접근에서 이미지와 비교하여이 프로토콜에서 종양 그룹을 침공. UMSCC1 orthotopic 종양을 품고 전체 마우스 혀 A.의 파라핀 섹션. Immunohistochemical 얼룩은 HNSCC 특정 세포 마커 emmprin (Zymed, 고양이 # 34-5600)에 대한 기본 항체와 함께 종래의 절차를 사용하여 실시되었다 1:1000 희석에서와 OmniMap DAB 안티 - RB ​​탐지 키트 (벤타나 고양이 # 760을 사용하여 시각 -149)는 철분 hematoxylin의 얼룩으로 따라갔다. 전체 혀 영역을 포함한 이미지 Optronics MicroFire CCD 카메라와 올림푸스 ZX70 비스 현미경에 4X 배율에서 개별적으로 수집하고 StereoINvestigator 이미징 패키지 (MBF Bioscience)를 사용하여 복원되었습니다. 종양은 혀 끝에 분명하다. 침입 앞면과 개별 종양 세포 그룹 (화살촉)을 보여주는 확대 지역은 대표적인 OSC19 종양의 (B). C. 니콘 NIS - 요소 렌더링에 표시됩니다. 향상된 윤곽 세부 사항 및 IGS 명확하게 시각화가 (화살촉) 분명하다. 모든 이미지 바 = 100 μm의.

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Orthotopic 마우스 모델은 머리와 목 암 1,2의 여러 ​​측면을 연구하는 데 유용 입증했습니다. 우리는 머리와 목의 종양 세포의 침략의 초기 이벤트를 연구하는 시스템으로 mCherry - 레이블 세포의 2 광자 현미경 이미징과 스콧 3 잘 설립 orthotopic 시스템을 결합했습니다. 이 절차에서는, 우리는 세포가 특히 부족 혀 크기로 인해 마우스 육주 이하에서 종양이 주사의 사이트에서 누설 수 있다고 지적했습니다. 우리는이 문제를 피하기 위해 기존의 마우스를 사용합니다. 이전 생쥐와 큰 혀 크기도 혀를에서 언어 동맥과 과도한 출혈의 파열을 피하기 위해 에이즈. 혀 크게 초기 주사의 사이트에 부풀 때 종양의 받아가 크게 향상됩니다. 주입 유체로 1-2시간 이내에이 붓기 가라 앉다가 흡수됩니다. 종양 성장 혀 표면에 작은 흰색 범프로 표시 주입 휴대폰 번호와 함께 분명 1~2주 게시물 사출 나타납니다. 우리는 또한 여기에 제시 우리의 연구에 사용된 40X 목적에서, 우리는 각각의 종양 세포를 구분하지 수 있지만 HNSCC 침략의 일반 모드를 요점을 되풀이하다 침입 셀 클​​러스터로 IGS을 식별하지 않습니다. 현재까지이 모델은 광범위 4-7 IHC 또는 발광 생물 방법을 사용하여 모니터링할 자궁 경부 림프절의 전이에 의해 측정 효율과 함께, 특정 분자의 역할뿐만 아니라 스콧 성장 침공에 여러 안티 종양 약물을 테스트하기 위해 사용되고 있습니다. 종양 침입 멀티 셀룰러 클러스터로 현장에 이미지 전체 종양에 두 광자 현미경의 응용 프로그램을 허용, 가까이 혀 표면 (그림 7)이 시스템 명단 형성. 절차는 또한 휴대폰 해상도 종양 침공을 시각화하는 이용하실 수 있습니다. 두 광자 현미경는 이전에 다음 ID로 orthotopic 8,9 및 이종 이식 8,10 모델에 머리와 목 암 치료 실험 연구를 이용했습니다. 그러나 이러한 보고서 및 프로토콜 사이의 두 가지 주요 차이점이 있습니다. 첫째,이 연구는 대상 / 가능한 순환에 충분한 액세스 권한이있는 유일한 종양 세포 검출을 제한, 머리와 목의 종양 세포를 확인하기 위해 세포 레이블을 사용합니다. 가능성이 recapitulates 초기 전이성 활동이 실험 매개 변수로 평가되지 않았음을 기본 사이트로 가까운 종양 세포의 두 번째 침공. 우리 프로토콜은 직접 마우스 방언 종양 진행 중 어느 시점 종양 세포 침공을 계량하는 기능을 제공합니다. 방법은 여기에서 설명한 해부 방언을 사용하는 절차를 설명하는 동안, 우리는 동시에 초기 침공, 지역 림프절의 참여와에 멀리 전이를 모니터링하는 bioluminescence와 함께 사용하기 위해 사는 생쥐의 이미지 종양의 침공이 방법을 채택하는 과정에서 현재 같은 동물. 생체내 이미징에 대한 프로토콜의 변경이 제대로 이미징 절차 동안 anesthetized 생쥐의 구강을 관개하기 위해뿐만 아니라 실용적인 시스템으로, 이미징하는 동안 마우스를 위치에 적절한 단계의 설계 및 유지 관리가 필요합니다. 일단 최적화된이 adaptations 잠재 프로 침해 분자 및 지역 침략과 오랜 시간 기간 동안 동물에 더 멀리 전이성 참여에 대한 테스트를 방지 침략적 화합물의 역할을 연구하는 기능을 제공합니다.

구강 편평 세포 암종의 orthotopic 마우스 모델에서 종양 세포 침략의 다중 광자 이미징

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

머리와 목 암의 로코 - 지역 침공은 전이성 위험에 연결되어 설계 및 환자 관리 전략을 구현 어려운 도전을 선물합니다. 구강 암 Orthotopic 마우스 모델은 해당 요소의 연구를 촉진하기 위해 개발되었습니다 영향을 침공 및 안티 종양 치료제를 평가하기위한 모델 시스템으로 제공하고 있습니다. 이러한 시스템에서는 구강 조직 내에 전파 종양 세포의 시각화는 일반적으로 기존의 조직학하거나 또는 생체내 발광 생물 방식에 함께 실시되었습니다. 이러한 기술의 주요 단점은 정확하게 3 차원에 기본 사이트에서 발생하는 초기 종양 세포 침공을 시각화하고 계량하는 고유의 무능력이다. 여기 우리는 언어를 구사하는 종양 확산의 멀티 vectorial 시각화를 허용하도록 두 개의 광자 이미징과 혀의 편평 세포 암종 (스콧)를 설립 모델을 결합하여 프로토콜을 설명합니다. OSC - 19 머리와 목의 종양 세포 라인은 안정 mCherry 형광 단백질 (LifeAct - mCherry)에 융합 F - 굴지 결합 펩티드 LifeAct을 표현할 수 있도록 설계되었습니다. 이러한 세포로 주입 Fox1 뉴 / 뉴 생쥐가 안정적으로 혀가 두 광자 현미경의 전 생체내 응용 프로그램에 의해 시각 수 있도록 종양을 형성. 이 기술은 종양 질량 orthotopic 시각화 및 로컬 지역 종양의 microenvironment의 중단없이 excised 방언 세포를 침입 수 있습니다. 또한이 시스템은 기본 종양 사이트에서 세포 이동을 침공 거리를 계산하여 종양 세포 침공의 부량 수 있도록합니다. 전체이 절차는 스콧의 침략과 지역 침략과 멀리 전이성 확산을 방지하기 위해 맞춤형 치료 요법에 기여하는 요인을 분석하는 향상된 모델 시스템을 제공합니다. 이 방법은 궁극적으로 생체내 설정에 다른 영상 modalities과 결합 될 가능성이있다.

표시 셀 다중 광자 현미경을 통해 혀를 이내 구강 암 종양 침략의 양적 모니터링 마우스 모델을 생성에 관련된 기술의 포괄적인 개요는 제공됩니다. 이 시스템은 침입 방지 화합물의 분자 평가 및 약물 효능을위한 유용한 플랫폼이 될 수 있습니다.

구강 편평 세포 암종의 Orthotopic 마우스 모델에서 종양 세포 침략의 다중 광자 이미징

두경부암의 국소-지역 침범은 전이 위험과 연관되어 있으며, 환자 맞춤형 치료 계획의 설계 및 시행에 있어 어려운 과제가 됩니다.

본 절차의 전반적인 목표는 혀의 종양 침습을 시각화하고 정량화할 수 있는 구강암 마우스 모델을 제작하는 것입니다. 이를 위해 먼저 LifeAct-mCherry를 렌티바이러스(Lentiviral)로 감염시키고 안정적인 클론 선택 과정을 거쳐, 이광자 이미징(two photon imaging)이 가능한 구강 편평세포암 세포를 생성합니다. 그 다음, 마취된 마우스의 혀에 LifeAct-mCherry로 표지된 세포를 주입하여 누드 마우스(nude mice)에 정위 이종이식(orthotopic xenograft) 종양을 형성시킵니다.그 후, 종양이 포함된 혀를 이광자 현미경으로 촬영합니다. 최종적으로, 신선한 혀 조직의 이광자 영상 촬영과 이후 일차 종양 및 지역적으로 침범한 세포군에 대한 컴퓨터 지원 3차원 재구성을 통해, 혀 근육 내 국소 구강 종양 침범을 정량화한 결과를 얻을 수 있습니다. 면역조직화학법이나 생체 발광 영상과 같은 기존 방법보다 이 기술이 갖는 주요 장점은 종양 세포의 침범을 3차원으로 정량 측정할 수 있다는 점입니다.이 기술의 함의는 구강암의 치료적 개입으로 확장되는데, 이는 종양 침습에 관여하는 단백질 분석뿐만 아니라 항침습 치료 전략에 대한 전임상 화합물의 평가를 위한 모델 시스템을 제공하기 때문입니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 사람은 혀에 종양 세포를 주입하고 이광자 현미경 관찰을 위해 혀를 준비하는 과정이 기술적으로 까다로우며 숙련도와 연습이 필요하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 종양 주입과 이광자 관찰 단계는 배우기 어렵고 전문적인 기술이 필요하므로, 이 방법의 시각화 자료가 매우 중요합니다. 배양을 시작하려면.10% FBS, 1% penicillin streptomycin 및 1% 비필수 아미노산이 첨가된 DMEM으로 구성된 완전 배지에서 인간 두경부 종양 세포주를 배양합니다. LIFE Act mCherry 코팅 서열을 pLenti 7.0 렌티바이러스 벡터로 옮기기 위해, 먼저 부모 mCherry cDNA의 SBF1 인식 부위에 세 개의 무음 돌연변이를 도입하는 부위 특이적 돌연변이 유발이 필요합니다. 다음으로, 양 끝에 EcoR1 및 SBF1 부위가 있는 수정된 Life Act mCherry 서열을 PCR로 증폭하여 pLenti 7.0에 서브클로닝합니다. 렌티바이러스 발현 시스템 배양에 따라 pLenti 7.0 LIFE Act mCherry 컨스트럭트를 생성하려면, 패키징 세포주 293T를 완전 배지에서 17~40% 밀도로 배양합니다.CalFoss를 사용하여 PLL 7.0 LIFE Act M cherry PS PACS two 및 P-VSVG 벡터를 각각 3:2:1 비율로 세포에 transfection합니다. 24시간 후, 배지를 신선한 완전 배지로 교체하고, 72시간 동안 12시간마다 배지를 수집 및 보충하며, 수집한 배지를 4°C에서 보관하여 LIFE Act M cherry가 안정적으로 발현되는 두경부 세포주를 제작합니다. 수집한 배지를 4°C에서 2000 RPM으로 10분간 원심분리하고, 바이러스가 포함된 상층액 1 mL를 OSC 19 또는 US CCC one 세포에 첨가하여 12시간 동안 배양합니다.세포를 헹군 후, 바이러스 1 mL를 추가로 첨가하여 12시간 동안 더 처리합니다. 내성 콜로니를 선택하기 위해 200 mg/mL의 puromycin이 포함된 배지에서 세포를 2주 동안 배양합니다. 형광 현미경을 통해 mCherry 발현 여부를 확인하여 생존한 콜로니를 시각적으로 선별합니다. 멸균된 3 mm 클로닝 디스크를 사용하여 양성 콜로니를 개별적으로 trypsin 처리합니다.동결 보관하거나 정위성 종양 이종이식편을 생성하기 위한 정위 주입에 사용할 때까지 200 mg/mL의 puromycin이 포함된 배지에서 양성 세포를 유지하십시오. trypsin-life Act. M cherry 발현 종양 세포를 원심 분리한 다음, 약 2.5 × 10⁴개의 세포를 50 µL의 완전 배지에 재현탁하십시오. 종양 세포를 27 gauge 0.5인치 바늘이 장착된 1 mL 주사기에 주입하십시오.다음으로 8주 된 암컷 athymic nude mice를 마취합니다. ketamine 80 mg/kg과 xylazine 10 mg/kg의 조합으로 투여합니다. 동물의 움직임이 멈추면 안연고를 도포하고, 발바닥의 발톱을 눌러 반응 여부를 확인합니다.마우스를 37~40°C 사이의 가열 패드 위에 유지합니다. 멸균 핀셋을 사용하여 혀 끝을 부드럽게 잡고 구강 밖으로 당깁니다. 각 혀의 한쪽 면에 세포를 천천히 주입하여 혀 중앙에 구형의 덩어리가 형성되도록 합니다.마우스에 kg당 2.1 mg의 요힘빈(yohimbine)을 주사하고, 마취 회복 상태를 관찰하기 위해 다시 가열 패드 위에 둡니다. 마우스를 부드러운 transgenic dough 식단이 들어 있는 멸균 케이지에 넣습니다. 2~3일마다 마우스의 체중을 측정하고, 종양 발생 여부를 육안으로 모니터링합니다.ex vivo 이미징을 위해 마우스 혀를 준비하려면, 서로 다른 시점에 종양을 보유한 마우스를 안락사시킵니다. 이산화탄소 흡입법을 사용하여 혀를 적출하고 1X PBS로 헹굽니다. 그 다음, 일반 취미 용품점에서 구입한 단사 재봉사와 8호 바늘을 사용합니다.혀를 일반적인 파라핀 조직 매립 카세트의 한쪽에 부착합니다. 혀가 고정되면, 카세트 어셈블리 전체를 1X PBS에 담급니다. 즉시 이광자 현미경을 사용하여 혀를 처리하고 이미징합니다.1X PBS가 담긴 60mm 디시에 혀 카세트를 담급니다. 이 디시를 이광자 현미경의 대물렌즈 아래에 위치한 신축식 캔틸레버 암의 맞춤형 홀더에 고정합니다. 40x 0.8 수치구경 수침 대물렌즈를 육안으로 확인 가능한 종양 병변 바로 위 또는 위에 배치합니다.60 milliwatts의 강도와 755 nanometers의 입력 파장을 가진 티타늄 사파이어 레이저를 이용한 이광자 현미경으로 혀를 촬영합니다. M cherry 신호를 최적화하기 위해, 15에서 100 micrometers 사이의 전체 조직 깊이에 걸쳐 1 micrometer 간격의 깊이에서 1 micrometer 연속 레이저 스캐닝 이미지를 수집합니다. 이 설정을 통해 조직 깊이가 최대 1 millimeter인 종양까지 분석할 수 있습니다.이미지 캡처를 위해 scan image를 사용하십시오. Scan image는 XY 갈바노미터 스캔 미러를 제어하기 위한 래스터 스캔 패턴의 2채널 출력을 생성하는 동시에, 데이터 수집 보드를 통해 광전증배관으로부터 최대 4채널의 신호 입력을 동시에 캡처합니다. Scan image는 대물렌즈의 Z축을 제어하여 Z-stack 이미지를 수집하며, 단일 또는 순환 모드로 타임랩스 이미지를 수집합니다.이미지를 16비트 깊이의 단일 TIF 파일로 저장하십시오. Amira 소프트웨어를 사용하여 Z-스택 이미지 세트가 포함된 TIF 파일을 열고, 종양 이미지 스택을 하나의 3차원 이미지로 렌더링하십시오. TEX 기능을 사용하여 3차원 렌더링을 생성하십시오.렌더링된 이미지에는 여러 개의 작은 분리된 침습 그룹(ig)을 포함한 커다란 원발성 종양 이미지가 나타날 가능성이 높습니다. 종양 부피를 측정하려면 원발성 종양 영역의 임계값을 설정하고, 이미지 스택의 각 슬라이스에서 배경 형광을 보정 및 제거하십시오. 각 침습 그룹에 대해서도 동일한 임계값 설정 절차를 반복하십시오.원발성 종양과 모든 침습 그룹(ig)을 선택한 후, 원발성 종양의 부피 측정값과 X, Y, Z 종양 OID 좌표를 결정합니다. 중심 종양 지점으로부터 ig까지의 거리를 계산하기 위해, ti = NT × VT × dt 식을 사용하여 종양 침습 지수(tumor invasive index, ti)를 계산합니다. 여기서 NT는 이미지 내 ig의 총 개수, VT는 모든 ig의 총 부피, DT는 원발성 종양의 중심에서 모든 침습 그룹이 이동한 총 거리를 나타냅니다.소프트웨어 내의 Nikon NIS elements로 원본 16 bit 흑백 팁 파일을 가져오면 지형적 세부 사항이 더 정밀한 3차원 렌더링을 생성할 수 있습니다. 이미지 스택으로부터 ND 파일을 생성하십시오. 그다음, 문서의 캘리브레이션을 수동으로 수행하여 픽셀 크기를 지정함으로써 더 고품질의 렌더링을 구현하십시오.Z 평면에 추가 슬라이스를 추가하십시오. 이 그림은 NIS elements 또는 미러 소프트웨어에서 획득한 이광자 이미지의 로우 데이터 예시를 보여줍니다. 이 그림에 나타난 것과 같이, 소프트웨어를 사용하여 설암의 로우 데이터를 재구성할 수 있습니다.이 패널은 Amira 소프트웨어의 TEX 기능을 사용하여 구현한 3차원 렌더링 예시를 보여줍니다. 여기서는 이미지 스택에서 개별 이광자 단면의 임계값을 설정하여 원발성 종양의 중심부(oid)뿐만 아니라 원발성 종양으로부터 침습한 그룹을 식별하는 예시가 제시되어 있습니다. 각 임계값 단면의 분석이 완료되면, Amira는 각 침습 그룹의 부피와 중심(Centro)으로부터 이동한 거리를 정량화합니다.이 데이터는 그래프로 나타낼 수 있으며, 종양 세포 침습의 전체 수준에 대한 수치를 얻는 데 사용할 수 있습니다. 여기에 표시된 일차 부위에 기인한 이미지는 기존의 병리학적 면역조직화학 염색으로 시각화한 종양의 대표 이미지와 기술된 프로토콜을 사용하여 촬영한 유사 종양의 3차원 이미지를 비교한 것입니다. 혀 적출부터 최종 3D 렌더링까지 숙달되면, 적절히 수행할 경우 이 기술은 약 2시간 내에 완료될 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 바늘로 혀를 관통하여 종양 세포를 소실하거나 종양 채취를 방해하지 않도록 주의하십시오. 이 절차 이후에 치료 화합물이나 단백질 수준이 조작된 세포를 테스트하여 구강암 침습에 대한 효능을 결정할 수 있습니다.in vivo 환경에서 렌티바이러스로 변형된 인간 종양 세포를 다루는 것은 위험하므로, 주입된 마우스를 취급할 때는 적절한 개인 보호 장비(PPE) 착용 및 BSL 2 인증 라미나 플로우 후드 내 작업과 같은 안전 예방 조치를 항상 준수해야 합니다.

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