Coupez-chargement: Un outil utile pour examiner l'étendue du couplage Tracer Gap jonction entre neurones rétiniens

L'objectif général de l'expérience de chargement par coupure suivante est d'examiner le degré de couplage par jonctions communicantes entre les neurones de la rétine intacte dans des conditions d'illumination contrôlées. La première étape consiste à inciser les rétines à l’aide d’une lame fine trempée dans une solution de neurobiotine, une molécule traceuse capable de diffuser à travers les jonctions communicantes ouvertes, mais pas à travers les membranes cellulaires. Dans la deuxième étape, les rétines sont incubées dans une solution de Ringer, ce qui permet la diffusion du traceur à travers les jonctions communicantes ouvertes.

Si le couplage par jonctions gap est faible, la fluorescence de la biotine neuro sera limitée aux neurones rétiniens situés près de la coupure. En revanche, si le couplage par jonctions gap est fort, la fluorescence sera détectée dans des neurones rétiniens éloignés de la coupure. Le principal avantage du marquage par coupure par rapport aux techniques existantes est qu'il est plus facile à réaliser sur des neurones ayant de petits corps cellulaires dans un tissu rétinien neural intact.

Il est également plus facile de contrôler les conditions d'illumination pendant le chargement par coupure que lors d'une étude électrophysiologique de neurones individuels dans un tissu rétinien intact. Étant donné que les stimulations lumineuses utilisées pendant l'enregistrement électrique peuvent elles-mêmes induire des modifications du couplage par jonctions gap, la démonstration de la technique sera effectuée par le Dr Chu Choi, postdoctorant de mon laboratoire. Dans cette procédure, un poisson rouge est maintenu en obscurité constante pendant la journée au moins une heure avant la chirurgie, et toutes les étapes suivantes jusqu'à la fixation du tissu rétinien sont également réalisées en journée en obscurité constante ; anesthésiez profondément le poisson rouge en ajoutant 150 milligrammes par litre de méthane sulfonate à l'eau de l'aquarium.

Ensuite, sacrifier le poisson rouge conformément aux directives fédérales et universitaires, puis retirer soigneusement ses globes oculaires. Ensuite, enlever la partie antérieure de chaque globe oculaire. Puis placer un morceau de papier filtre sur la partie postérieure de l’œil et retourner le papier filtre et l’œil de manière à ce que le papier filtre se retrouve sous la partie postérieure de l’œil.

Maintenant, retirez délicatement la partie postérieure de l’œil, y compris la sclérotique et l’épithélium pigmentaire, du poisson rouge préalablement adapté à l’obscurité. Coupez le nerf optique à l’aide d’une paire de ciseaux fins. La rétine nerveuse du poisson rouge, orientée avec la face des photorécepteurs vers le haut, doit désormais être fixée sur du papier filtre avant l’énucleation, tandis que le poisson est sous anesthésie, dans cinq millilitres de solution de Ringer au carbonate oxygénée, avec ou sans médicament test, ajoutée dans chaque puits d’une plaque à six puits, après la dissection de la rétine nerveuse intacte de la partie postérieure de l’œil.

Transférez les rétines dans les puits en maintenant l'obscurité constante. Scellez ensuite les puits avec du paraforme et laissez le tissu incuber pendant 30 minutes. Préparez 100 microlitres de solution traceuse en dissolvant 0,5 % de neurobiotine dans une solution de Ringer juste avant de sectionner la rétine.

Ensuite, ajoutez la solution de neurobiotine dans une boîte de Pétri en verre. Puis, tapez doucement le papier filtre auquel est attachée la rétine sur une serviette en papier. Pour éliminer l'excès de solution de Ringer, trempez une lame de rasoir dans la solution de neurobiotine et pratiquez une incision radiale perpendiculaire à travers la rétine et le papier filtre.

Ensuite, plongez à nouveau la lame de rasoir dans la solution de neurobiotine et coupez la rétine une deuxième fois. Répétez cette opération jusqu'à quatre coupes par rétine. À cette étape, transférez la rétine dans une solution de Ringer fraîche, avec ou sans médicament test, pendant 15 minutes afin de permettre la charge et la diffusion.

Lavez-le trois fois avec du ringer frais, milieu avec ou sans médicament testé, pendant cinq minutes chacun. Fixez ensuite la rétine avec du paraformaldéhyde à 4 % dans une solution tampon phosphate 0,1 molaire à température ambiante pendant une heure. Par la suite, lavez la rétine avec du PBS 0,1 molaire toute la nuit à quatre degrés Celsius en la plaçant au réfrigérateur le jour suivant.

Faire réagir la rétine avec de la streptavidine Alexa 488 à 2 % dans du PBS 0,1 M et 0,3 % de Triton X-100, pour une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre, puis incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, laver la rétine trois fois avec du PBS 0,1 M à température ambiante, chaque lavage durant 10 minutes.

Détacher la rétine du papier filtre dans le PBS. Ensuite, à l’aide d’un pinceau fin, monter la rétine côté photorécepteurs vers le haut sur une lame à l’aide d’un milieu de montage Vector Shield. Transférer la lame vers un microscope confocal à balayage laser et prendre des images à la même résolution d’agrandissement et avec les mêmes paramètres pour chaque condition expérimentale afin de permettre des comparaisons des effets de différentes conditions expérimentales sur l’importance du couplage fonctionnel par traceur de lacune, comme indiqué.

Voici l'étendue du couplage des traceurs de cellules photoréceptrices pendant la journée en obscurité constante, comparée à celle observée pendant la journée en obscurité constante en présence d'un antagoniste sélectif du récepteur D2 de la dopamine. Notez que la coupe au rasoir est située à gauche dans les deux images. Bien qu'une seule image puisse contenir toutes les cellules marquées, il est recommandé d'acquérir une pile Z de la région d'intérêt et de la projeter en une seule image présentée ici.

Voici l'étendue du couplage des traceurs dans les cellules photoréceptrices lorsqu'on progresse successivement à travers un tel Zack. Notez que la coupe au rasoir sur cette image se trouve à droite. Pour quantifier l'étendue du couplage du traceur dans le navigateur d'images LSM, ouvrez l'image, puis cliquez sur exporter et enregistrez l'image sous forme de fichier TIF 16 bits non compressé ; la barre d'échelle doit être incluse dans cette image TIF à l'aide du logiciel NIH Image J.

Mesurez l'intensité de fluorescence de la neurobiotine marquée par Alexa 488 à partir d'images de faible grossissement de rétines montées en sandwich. Ouvrez le fichier TIFF à l'aide du logiciel ImageJ, puis tracez une ligne droite correspondant à la barre d'échelle. Ensuite, accédez à Analyser, définissez l'échelle, puis saisissez la distance connue et l'unité de longueur.

Ensuite, cliquez sur OK. Les mesures de fluorescence peuvent maintenant être présentées en unités calibrées telles que les millimètres. Sélectionnez ensuite la zone d'intérêt à l'aide de l'outil de sélection rectangulaire.

Le pic de fluorescence doit être positionné au bord gauche de votre sélection. Assurez-vous qu'aucun signal de fluorescence ne se trouve près du bord droit. Cliquez sur analyser et tracer le profil pour les données du témoin diurne obtenues en obscurité constante.

Une courbe présentant une décroissance exponentielle s'affiche de gauche à droite. Cliquez ensuite sur copier dans la fenêtre contextuelle et collez-la dans Excel. Deux colonnes apparaissent désormais : l'une indiquant la distance par rapport à l'incision, et l'autre montrant l'intensité de fluorescence en fonction de la distance par rapport à l'incision.

À titre de comparaison, les étapes ci-dessus sont répétées avec des données obtenues en obscurité constante dans la journée. En présence de spit bro, divisez chaque valeur de fluorescence brute par la valeur maximale de fluorescence afin d'obtenir l'intensité de fluorescence relative. Copiez deux colonnes correspondant à la distance par rapport à la coupure et à l'intensité de fluorescence relative, puis collez-les dans le logiciel Origin.

Ces étapes sont illustrées à la fois pour le témoin diurne et pour l'échantillon diurne. À ce stade, les données expérimentales sont ajustées aux résultats à l'aide d'une fonction de décroissance exponentielle. Utilisez un test T ou un Inova pour comparer les valeurs de la constante de distance dans différentes conditions expérimentales.

Des fonctions exponentielles et des analyses statistiques des données de contrôle en journée, de pipérone en journée et de contrôle en nuit sont présentées à titre comparatif. Voici des exemples de l'importance du couplage par traceur des cellules photoréceptrices dans la rétine de poisson rouge adaptée à l'obscurité, en journée A, en nuit B, et en journée en présence d’un antagoniste sélectif des récepteurs D2 de la dopamine, tel qu'observé par la technique de chargement par coupe. Toutes les images de microscopie confocale ont été obtenues avec les mêmes paramètres afin de permettre la comparaison.

Dans ce graphique, l'intensité de fluorescence pour trois conditions expérimentales est tracée en fonction de la distance par rapport à la coupure et ajustée par une fonction exponentielle. La technique de chargement par coupure est utilisée pour quantifier le degré de couplage par jonctions communicantes en calculant les valeurs de la constante de distance, comme illustré ici pour trois conditions expérimentales. La technique de chargement par coupure peut également être utilisée pour étudier les synapses électriques entre d'autres types cellulaires dans la rétine et chez d'autres espèces.

Par exemple, ces deux figures illustrent que les cellules horizontales de type A et de type B du lapin présentent un couplage homologue au traceur après chargement par coupure et diffusion de la neurobiotine dans des conditions de noir adaptatif. Nous avons utilisé la technique de chargement par coupure pour étudier l'ampleur de la diffusion du traceur à travers les jonctions gap entre les bâtonnets et les cônes pendant le jour et la nuit. En outre, cette technique peut être utilisée pour déterminer si le couplage au traceur entre d'autres neurones rétiniens est contrôlé par l'horloge rétinienne et/ou par des conditions lumineuses spécifiques d'alternance lumière-obscurité.

Il peut également être utilisé pour étudier le couplage par traceur entre les neurones dans d'autres régions cérébrales.