Autologe endotheliale Vorläuferzellen Cell-Sätechnik und Biokompatibilitätstestung Für Herz-Kreislauf-Geräte in Großtiermodell

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, vaskuläre Implantate mit autologen, aus dem Blut gewonnenen endothelialen Vorläuferzellen zu besiedeln und anschließend die Wirkung dieser Behandlung auf die Thrombosebildung in einem Großtiermodell zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem eine periphere Blutprobe von Schweinen entnommen wird, um späte porcine endotheliale Vorläuferzellen mit proliferativer Auswuchsaktivität zu isolieren. Anschließend ein implantierbares Gerät.

In unserer Prinzipstudie wird der Titanrohr mit den autologen PC besetzt. Anschließend wird das Gerät in die untere Hohlvene des Schweins implantiert. Die Ergebnisse zeigen einen Schutz vor Thrombose, basierend auf der Durchgängigkeit des mit EPC besetzten Titanrohrs im Vergleich zum Kontrollrohr und dem verstopften blanken Metallrohr.

Die Chirurgie an der Duke University ist bestrebt, bahnbrechende und innovative Forschung zu fördern. Die folgende Präsentation ist ein Beispiel dafür, wie wir interdisziplinär und fächerübergreifend zusammenarbeiten, um die Medizin voranzubringen. Dr. EK leitet eine Forschungsinitiative zur Entwicklung einer Zellbesiedlungstechnologie, die Thrombosen verhindern soll, indem die blutberührende Oberfläche von vaskulären Implantaten mit den eigenen Vorläuferzellen des Patienten ausgekleidet wird.

Da diese Zellen von denselben Patienten stammen, die das Implantat erhalten werden, vermeiden wir eine Abstoßung durch das Immunsystem. Unser Erfolg und die hier beschriebenen Methoden sind das Ergebnis einer umfangreichen Teamleistung. Die chirurgische Implantation wird von Sean Gage aus der Abteilung für Gefäßchirurgie, von Whitney Lane, einer Medizinstudentin der Duke University, und von mir durchgeführt.

Ich möchte nun Alexander Janssen vorstellen, einen Doktoranden aus dem Fachbereich Biomedizinische Technik, der uns den Zellseeding-Prozess detailliert erläutern wird. Ich werde demonstrieren, wie Titanröhrchen kurz vor der Implantation in ein Schweinemodell mit aus Blut gewonnenen endothelialen Progenitorzellen besiedelt werden. Diese Methode dient als Machbarkeitsnachweis, und die gleichen grundlegenden Prinzipien können auf viele andere implantierbare Geräte angewendet werden, beispielsweise auf Nitinol-Stents und mechanische zirkulatorische Assistenzsysteme. EPCs werden isoliert, indem die mononukleäre Zellfraktion von Schweineblut ausplattiert wird, und erscheinen gewöhnlich nach etwa sieben Tagen.

Sie sind an ihrer typischen kieselsteinartigen Morphologie erkennbar. Vermehren Sie EPCs in der Kultur auf eine Gesamtzahl von 9 Millionen Zellen. Waschen Sie die vorbereiteten EPCs zweimal in serumfreiem Medium aus, wobei darauf geachtet werden sollte, ihre Lichtexposition während und nach der Markierung zu begrenzen.

Decken Sie die Zellen anschließend mit einer fluoreszierenden Markierung, PKH 26, ab und notieren Sie die applizierte Lösungsmenge. Inkubieren Sie die Zellen vier Minuten bei Raumtemperatur. Beenden Sie die Markierungsreaktion, indem Sie eine Minute später ein äquivalentes Volumen Schweineserum zur Farbstofflösung hinzufügen.

Verdünnen Sie die kombinierten Lösungen im Verhältnis eins zu eins mit vollständigem Wachstumsmedium. Danach aspirationsieren Sie die Flüssigkeit und spülen die Zellen dreimal mit vollständigem Wachstumsmedium, gefolgt von zwei Waschungen mit DPBS ohne Calcium- oder Magnesiumchlorid. Anschließend bedecken Sie die Zellen mit Trypsin, notieren Sie das verwendete Volumen und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius.

Nach dreiminütiger Inkubation unter dem Mikroskop überprüfen, ob die Zellen abgelöst sind, und gegebenenfalls doppelt so viel Trypsin-Neutralisationslösung zugeben wie zuvor Trypsin hinzugefügt wurde. Die Zellsuspensionen in einem einzigen Reaktionsgefäß vereinigen und die Zelldichte mit einem Hämozytometer bestimmen. Abschließend die Zellsuspension zentrifugieren und die Zellen in mindestens 4,5 Milliliter serumfreiem Medium resuspendieren.

Nach der Vorbereitung des Schweins für die Operation die Mittellinie mit einer Klingennummer 15 vom zweiten Satz der Speicheldrüsen aus incisieren. Kranial bis zum vorletzten Satz kaudal mithilfe von Elektrokauter fortsetzen. Die Präparation bis zur Bauchfascie fortsetzen.

Heben Sie das Peritoneum mit einer feinen Pinzette an und öffnen Sie es vorsichtig mit einer Metzenbaum-Schere, führen Sie die Harnblase heraus und setzen Sie eine Umstichnaht aus Vicryl 3-0 in die Blasenwand ein. Führen Sie einen Stichschnitt in deren Mitte durch und bringen Sie einen 16-Fr.-Foley-Katheter über die Inzision ein. Anschließend verabreichen Sie intravenöse Flüssigkeit, um die Harnproduktion während der Operation auf mindestens ein Milliliter pro Kilogramm Körpergewicht pro Stunde einzustellen.

Anschließend den kleinen erweiterten Darm außerhalb der Bauchhöhle platzieren und zwei chirurgische Bour-Retraktoren anbringen, um die hintere Bauchhöhle freizulegen und die Vena cava inferior (VCI) durch scharfe und stumpfe Präparation zu identifizieren. Die VCI vorsichtig vom umgebenden Gewebe lösen. Danach das Gefäß vom rechten Nierenarterienabgang bis zur Bifurkation der VCI distal abpräparieren.

Äußerste Vorsicht während der Präparation der V. cava inferior, da bereits ein sehr kleiner Defekt an der V. cava inferior zu einer raschen Blutung und letztlich zur Exsanguination des Tieres führen kann. Alle Seitenäste des V.-cava-inferior-Abschnitts erfordern besondere Sorgfalt, insbesondere die beiden großen hinteren Lumbalvenen unmittelbar proximal zur Bifurkation der V. cava inferior. Häufig findet sich auf der dorsalen Seite eine große Lumbalvene.

Dissezieren Sie diese Vene frei und führen Sie sie mit Gefäßschlingen. Beginnen Sie nun parallel zur Operation, die Implantate mit EPCs zu besiedeln, bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen. Die Gewebesitzgerüste aus Titanröhrchen müssen vollständig zusammengebaut und in einem sterilen Bereich einsatzbereit sein.

Öffnen Sie die gassterilisierte Titanrohranordnung in einer 5-cc-Spritze. Entfernen Sie anschließend den Kolben aus der 5-cc-Spritze, verwerfen Sie ihn jedoch nicht. Befestigen Sie eine feste Verschlusskappe an der Spritze. Füllen Sie die Spritze mit der EPC-Suspension, indem Sie eine Pipette verwenden.

Danach den Kolben wieder einsetzen. Die Kappe entfernen und das Luer-Ende der Spritze in die offene Silikonschlauchleitung der Vorrichtung einführen, bis sie fest sitzt, jedoch nicht weiter. Eventuelle Blasen entfernen, indem die Zelllösung langsam vorgeschoben wird, bis sie die Oberseite des Kopfstücks erreicht.

Danach die Vorrichtung mit einer Lockstoffkappe verschließen und in einem sterilen Handschuh mit Klebeband fixieren. Die gesamte Vorrichtung in einen gefrästen Spritzenhalter einsetzen und in einen 37 Grad Celsius warmen Inkubator stellen. Mithilfe eines Messgeräts sicherstellen, dass die Sitzkammern waagerecht ausgerichtet sind, und die Vorrichtung unter leichter Rotation inkubieren lassen.

Setzen Sie die Operation unmittelbar nach der Ligatur der V. cava inferior fort, indem Sie 100 Einheiten Heparin pro Kilogramm Schwein verabreichen. Danach klemmen Sie die V. cava inferior unverzüglich in einem Winkel von 45 Grad distal an der V. cava inferior und der Lumbalvene und anschließend proximal ab. Verwenden Sie als Nächstes eine Skalpellklinge Größe 11 und eine Gefäßschere, um eine vier Zentimeter lange longitudinale Venotomie zwischen den proximalen und distalen Klammern anzulegen.

Entfernen Sie jegliches Blut aus der V. cava inferior und spülen Sie deren Lumen mit steriler DPBS. Bringen Sie nun das Implantat mit angesiedelten EPC oder ein metallenes Kontrollimplantat in die V. cava inferior ein, um Austrocknung der Zellen und Luftansammlungen zu verhindern. Füllen Sie die V. cava inferior mit DPBS, die Calciumchlorid und Magnesiumchlorid enthält.

Danach verschließen Sie die Venotomie mit einer laufenden Vier-Null-Prolinnaht und entfernen eine proximale Klemme, um die V. cava inferior durch eine geringe Rückblutung zu entlüften. Nach der Blutung entfernen Sie die distale Klemme, um die Implantation an Ort und Stelle zu halten. Legen Sie eine Haltenaht in den PVC-Schlauch, der durch die Venenwand verläuft.

Schließen Sie die Faszie mit OPDS an einer CT-Nadel. Schließen Sie den subkutanen Raum mit zwei o Vicryl-laufenden Nähten. Anschließend verschließen Sie die Haut mit Hautklammern.

Verabreichen Sie bis zu 20 Milliliter 0,25 % Marcaine subkutan entlang der Schnittstelle und bedecken Sie die Wunde zur Schmerzlinderung mit Mull und Tegaderm. Verabreichen Sie Flu Nixon und Oxymorphon bei Bedarf subkutan. Beenden Sie die Anästhesie und kehren Sie das Tier in seinen Käfig zurück, sobald es aufwacht, und pflegen Sie es über die nächsten sieben Tage.

Verabreichen Sie Atri alle 24 Stunden als antibiotische Prophylaxe und stellen Sie sicher, dass das Fentanyl-Pflaster, das vor der Operation angebracht wurde, insgesamt drei Tage lang haftet. Nach drei Tagen wurden die sitzenden Titanröhrchenimplantate entfernt und die inneren Oberflächen untersucht. Bei einer Anregungswellenlänge von 550 Nanometern fand sich in einem weiteren Röhrchen eine zusammenhängende Schicht fluoreszenzmarkierter Zellen.

Die Schnittzellen wurden zusätzlich mit einem Markierungsmolekül für die Plättchen-Endothelzell-Adhäsion gefärbt, um die Zellgrenzen sichtbar zu machen. Eine Vielzahl verschiedener Färbungen kann bei diesem Verfahren verwendet werden. Im Gegensatz dazu verschließt ein reiner Titanröhrchen-Implantat vollständig im prothrombotischen Umfeld mit niedriger Scherbelastung der Vena cava inferior.

Wie in den Bildern A und C veranschaulicht, ist der zellbesiedelte Titanrohr in Bild B dargestellt und blieb nach unserem Say-Isolationsverfahren mit Spitzenvolumen an Blut gerinnungsfrei. EPC erscheinen nach durchschnittlich sieben Tagen in Kultur. Während des chirurgischen Eingriffs ist es äußerst wichtig, die V. cava inferior (VCI) sowohl sorgfältig als auch schonend zu freilegen, da bereits der kleinste Riss in der VCI oder ihren Seitenästen zu einer Exsanguination des Schweins führen kann. Nach diesem Verfahren können andere blutkontaktierende Materialien rasch endothelialisiert werden, um eine Thrombose zu verhindern.

Endotheliale vaskuläre Stents, beispielsweise mit unseren EPCs, ahmen die natürliche Auskleidung der Blutgefäßwand nach und könnten nach ihrer Entwicklung eine Stent-Restenose und Thrombose verhindern. Unsere Schnell-beschichtende Technologie ermöglicht es, intravasale Geräte innerhalb weniger Minuten im Operationssaal oder Katheterlabor mit endothelialen Vorläuferzellen aus dem Blut des Patienten zu beschichten. Daher ist ein verlängerter ex vivo-Kulturaufwand nicht notwendig.

Die Zeit am Gerät selbst wird vermieden, und die Technologie wird praktisch für die Übertragung in die klinische Anwendung.