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Monitoramento da ubiquitina-proteassoma Atividade em células vivas Usando um Degron (dgn) desestabilizado Green Fluorescent Protein Protein Repórter (GFP) com base em
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JoVE 신문 생물학
Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Monitoramento da ubiquitina-proteassoma Atividade em células vivas Usando um Degron (dgn) desestabilizado Green Fluorescent Protein Protein Repórter (GFP) com base em

DOI:
10.3791/3327-v

•

10:25 min

•

November 10, 2012

•

, , , ,
1Molecular and Cell Biology,Institute for Biomedical Aging Research, 2Department of Gerontology and Geriatrics, Netherlands Consortium for Healthy Aging,Leiden University Medical Center

Chapters

  • 00:00Title
  • 01:21Virus Production
  • 04:11Titering of Virus
  • 06:13Transduction of Human Diploid Fibroblasts
  • 07:19FACS Experiments
  • 08:50Proteasomal Activity in vivo
  • 10:04Conclusion

Summary

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Um método para monitorizar a actividade de ubiquitina-proteassoma nas células vivas é descrito. A degron-GFP-desestabilizado (GFP-dgn) e uma proteína de fusão GFP estável dgnFS-são gerados e transduzidos para a célula utilizando um vector de expressão lentiviral. Esta técnica permite a geração de um estábulo GFP-dgn/GFP-dgnFS linha celular que expressa em que a actividade de ubiquitina-proteassoma podem ser facilmente avaliados utilizando epifluorescência ou citometria de fluxo.

Tags

Ubiquitin-proteasome ActivityDegronGreen Fluorescent Protein (GFP)Reporter ProteinProteolysisIntracellular OrganelleAbnormal ProteinsMisfolded ProteinsDamaged ProteinsOxidized ProteinsProteasome MaintenanceCellular ProcessesStress ResponseCell Cycle RegulationCellular DifferentiationImmune System ResponseUbiquitin-proteasome System DysfunctionTumorsNeurodegenerative DiseasesCellular SenescenceOrganismal AgingPrimary CellsLentiviral Expression VectorsTransfection Efficiency

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