Patch-clamp mesures de capacité et de Ca ^{2 +} Imagerie à terminaisons nerveuses rétiniennes unique en tranches

L’objectif général de cette procédure est de préparer des coupes rétiniennes intégrées dans la gélose pour l’étude des microcircuits situés dans les terminaisons nerveuses des cellules bipolaires présynaptiques. Ceci est accompli en obtenant d’abord la rétine à partir d’un œil de poisson rouge adapté à l’obscurité et en coupant un petit morceau rectangulaire de cette rétine. Le morceau rétinien est ensuite immergé dans une solution de gélose transparente et à faible point de fusion, qui est ensuite solidifiée dans une belle solution de tranche froide.

L’étape suivante consiste à trancher le bloc de gélose solide contenant le morceau rectangulaire de rétine à l’aide d’un vibromasseur. La dernière étape consiste à visualiser, identifier et corriger. Clamp une terminaison nerveuse de cellule bipolaire.

En fin de compte, les résultats montrent le courant calcique pré-synaptique et l’exocytose physique synaptique avec des mesures de capacité membranaire à partir de terminaisons cellulaires bipolaires atomisées et intactes. Bonjour, je m’appelle Han Kim. Je suis postdoc en PCO ou en laboratoire à l’Institut Burham.

Aujourd’hui, je vais présenter la préparation de tranche intégrée AGA de la rétine faciale froide et démontrer la mesure de la capacité de patch clamp à un seul pipeline de. Pour commencer cette procédure, hemis chaque œil d’un poisson rouge en coupant uniformément autour de l’avant de l’œil avec une paire de ciseaux à ressort. Placez ensuite les œilletons dans une solution de tranches réfrigérée sans calcium.

Si nécessaire, retirez l’objectif à l’aide d’une pince à épiler. Ensuite, retirez l’épithélium pigmentaire attaché à la rétine en décollant la rétine de l’œilleton avec une paire de pinces fines à pointe inclinée à 45 degrés. Après cela, coupez le nerf optique avec une paire de pinces fines ou des ciseaux à ressort.

Appliquez ensuite l’aspiration à l’aide d’une pipette à pâtes modifiée ou d’une pipette de transfert à grande pointe. Pour enlever la rétine, retirez délicatement le reste de l’épithélium pigmentaire attaché à la rétine. La surface de la rétine nettoyée et saine doit apparaître lisse.

Traitez ensuite la rétine isolée avec environ 0,03 % d’IDE plus pendant 15 à 30 minutes à température ambiante. Pour enlever l’humeur vitrée, notez que la procédure doit être effectuée dans des conditions de faible luminosité. À l’étape suivante, coupez un morceau rectangulaire de rétine d’environ deux par deux millimètres, qui contient toute l’épaisseur de la rétine en enlevant les bords incurvés avec une lame de rasoir.

Transférez ensuite le morceau rétinien dans un petit récipient rempli de solution de gélose et essayez de minimiser la quantité de solution autour de la rétine lorsqu’elle est placée dans la gélose liquide. Ensuite, plongez la rétine avec la gélose directement dans la solution de tranche glacée afin de solidifier l’agar. Ensuite, coupez le bloc de gélose solide contenant le morceau rectangulaire de rétine en un cube un par un centimètre.

Collez le bloc à la surface de la plaque de tranchage dans la chambre de tranche preco. Ensuite, coupez le bloc en tranches d’une épaisseur de 200 à 250 microns dans la solution de tranche glacée. À l’aide d’un vibrato, on peut obtenir un total de cinq à 10 tranches, qui sont viables pendant environ cinq à six heures.

Après cela, transférez l’une des tranches dans la chambre d’enregistrement. Placez un cadre en platine en forme de U avec une grille de fils de nylon sur le dessus de la tranche. Perfuser la tranche en continu à raison d’un à deux millilitres par minute avec une solution d’enregistrement bouillonnée de carbogène.

Dans cette étape, utilisez une seringue avec un embout filtrant de 0,2 micron pour remplir la pipette patch en verre avec la solution interne à un ou deux centimètres de l’arrière de la pipette. Ensuite, retirez les bulles d’air de la pointe. Fixez la pipette dans le support.

Appliquez une pression positive sur la pipette et déplacez-la vers le terminal ciblé à l’aide d’un micromanipulateur tout en déplaçant la pointe vers le bas à travers la tranche. Déplacez la pipette dans le sens du balayage latéral pour vous assurer que la tranche n’est pas tirée avec la pointe. Déplacez ensuite la pointe de la pipette autour du terminal pour nettoyer la surface de la membrane.

Poussez la pointe vers le bas contre le bord de la borne pour créer une fossette et relâcher la pression positive. Si un joint giga ohm n’est pas formé, appliquez immédiatement une légère pression négative sur la pipette. Une fois qu’un joint giga ohm est formé, basculez l’amplificateur E PC neuf patch clamp en mode d’enregistrement onsell et modifiez le potentiel de maintien à moins 60 ou moins 70 millivolts.

Appliquez la correction de capacité rapide et attendez que le joint se stabilise entre cinq et 10 giga ohms. Ensuite, rompez la membrane avec une aspiration nette et douce. Pour établir la configuration de l’enregistrement de l’ensemble de la cellule.

Vous pouvez également utiliser une aspiration buccale au lieu d’une seringue. Une fois que la configuration de l’ensemble de la cellule a été établie sur une borne MB atomisée, appliquez une dépolarisation par paliers de 200 millisecondes de moins 70 à zéro millivolts. N’oubliez pas qu’une onde sinusoïdale de deux kilohertz en mode pince de tension est appliquée avant et après cette dépolarisation Afin de mesurer la capacité de la membrane, la dépolarisation permet la mesure directe des courants calciques entrants activés par l’ouverture de canaux calciques de type L voltage-dépendants avec une solution interne à base de césium.

En parallèle, on est en mesure de surveiller le saut de capacité causé par l’exocytose dépendante du calcium des vésicules synaptiques, ce qui augmente la surface de la membrane. Si une cellule bipolaire MB intacte est patchée avec la pipette sur la terminaison synaptique, aucun courant calcique discernable ne sera observé en raison des courants de fuite importants dus au couplage de jonction lacunaire dans les droits de dos des cellules bipolaires MB. Ce que l’on observe est une grande fuite vers l’extérieur comme un courant.

Cependant, il est toujours possible de surveiller le saut de capacité avec un stimulus sinusoïdal à haute fréquence activé avant et après l’étape de dépolarisation montrée. Voici les exemples d’I-R-D-I-C, images de M terminaisons de cellules bipolaires. Les bornes intactes sont plus susceptibles d’apparaître elliptiques comme le montrent A et B, tandis que C montre la borne misée, qui apparaît ronde et circulaire.

La méthode de remplissage de colorant peut également être utilisée pour classer les bornes des cellules. Voici les exemples d’images de fluorescence de terminaisons de cellules bipolaires MBI avec un axone intact en D, un axone partiellement coupé en e et un axone complètement retiré en F. Leurs teria sont indiqués par les flèches bleues. Voici les mesures directes de l’exocytose des signaux d’imagerie calcique et de rétroaction inhibitrice.

Dans une terminaison de cellule bipolaire MB, une concentration transitoire croissante de calcium dans la téléria d’une borne MB a été activée par une dépolarisation par paliers de pince de tension dans une l’image de fluorescence correspondante de la téléria MB peut être observée dans B.Des exemples de dépression synaptique à court terme de la libération de neurotransmetteurs sont illustrés dans C.Lors de la tentative de cette procédure, Il est important de se rappeler de minimiser la quantité de solution autour de la rétine lorsqu’elle est placée dans la gélose du kit. Cela améliorera la fixation du latinisé à partir du bloc de gélose.