توجه الخلوي الذاتي الجمعية الى افتعال خواتم نسيج الخلايا المستمدة من النشاط الحيوي لتحليل وهندسة الأنسجة

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء بنيات نسيجية ثلاثية الأبعاد من خلايا متجمعة ومصفوفة مشتقة من الخلايا يمكن استخدامها في التحليل الوظيفي. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تفريز قالب من البولي كربونات لإنشاء آبار حلقية ذات قاع مستدير. بعد ذلك، يتم صب مادة بولي ديميثيل سيلوكسان أو PDMS فوق قالب البولي كربونات لإنشاء نموذج.

ثم يُستخدم قالب PDMS لتشكيل آبار aros. وتتمثل الخطوة النهائية في استزراع الخلايا داخل آبار aros للسماح لها بالتجمع وتشكيل حلقات نسيجية متماسكة. وفي النهاية، يمكن استخدام هذه الطريقة لتحقيق التجميع الذاتي للخلايا وهندسة الأنسجة باستخدام أنواع مختلفة من الخلايا، كما تتيح تحليل مساهمة الخلايا والمصفوفة خارج الخلوية المشتقة من الخلايا في بنية النسيج ووظيفته.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بنهج هندسة الأنسجة الأخرى في قدرتنا على إنشاء بنيات نسيجية بالكامل من الخلايا والمصفوفة خارج الخلوية التي تنتجها بسرعة أكبر مما تم الإبلاغ عنه سابقاً، وبصيغة ملائمة للتحليل الميكانيكي. ابدأ بطحن قطعة من البولي كربونات بسمك نصف بوصة لإنشاء 15 بئراً حلقية ذات قاع مستدير بقطر عمود مركزي يبلغ 2 mm. نظف قالب البولي كربونات لإزالة أي بقايا بلاستيكية ناتجة عن عملية الطحن واترك القالب ليجف. بعد ذلك، اخلط PDMS بنسبة 10 إلى 1 من القاعدة إلى عامل المعالجة. قم بإزالة الغاز من المحلول للتخلص من جميع فقاعات الهواء ثم صبه في قالب البولي كربونات.

بعد ذلك، قم بإزالة الغازات من الخليط على القالب مرة أخرى لإزالة أي فقاعات هواء متبقية، ثم قم بمعالجة PDMS في فرن عند 60 °C لمدة أربع ساعات، وأثناء معالجة PDMS، قم بإذابة 2% AROS في DMEM. وبمجرد اكتمال المعالجة، قم بإزالة قالب PDMS بعناية عن طريق تقشيره ببطء بعيداً عن البوليكربونات، ثم اغسل PDMS بالصابون والماء وقم بمعقمته بجهاز الأوتوكلاف مع محلول DMEM AROS. الآن، ضع قالب PDMS المعقم على سطح مستوٍ واملأه بـ aros المصهور عن طريق سحب aros أولاً باستخدام الماصة في كل قالب من القوالب المركزية، ثم سحب aros في المساحة المحيطة بها.

اترك الـ aros لتتصلب لمدة 15 دقيقة تقريباً. بعد ذلك، اقلب القالب لتحرير الـ aros من الـ PDMS. قم بقص الزوائد من الـ aros حول كل بئر، ثم ضع بئراً واحداً من الـ aros في كل بئر من أبار طبق ذي 12 بئراً.

أضف وسط زراعة الخلايا حول الجزء الخارجي من بئر aros دون تغطية الجزء العلوي من البئر. ثم ضع الأطباق في الحاضنة للسماح لها بالوصول إلى حالة التوازن أثناء تحضير الخلايا. عند وصول الخلايا إلى درجة تلاقي 90%، قم بمعالجة خلايا العضلات الملساء في الشريان الأورطي للفئران بإنزيم trypsin وأعد تعليقها.

قم بتعليق الخلايا بتركيز 5 × 10⁶ خلية لكل ملليلتر. ثم انقل بواسطة الماصة 100 µL من معلق الخلايا المعاد تعليقها إلى كل بئر من آبار الـ aros المتوازنة. استخدم حركة دائرية لتوزيع الخلايا في كل بئر من الآبار.

ضع الأطباق في الحاضنة لتظل دون تحريك لمدة 24 ساعة. قم بتغيير الوسط الغذائي كل يومين عن طريق شفط الوسط من حول البئر ثم إعادة ملء كل بئر حتى يغمر قالب aros بالكامل. وفي نهاية عملية الزرع، املأ طبق بتري صغير بـ PBS.

قم بإزالة كل حلقة من قالب aros الخاص بها عن طريق سحبها فوق العمود المركزي. ضع الحلقات في أطباق Petri تحتوي على PBS Center، وضع حلقة واحدة تحت نظام التصوير الرقمي. استخدم برنامج اكتشاف الحواف لقياس سمك الحلقة في أربعة مواضع: الأعلى، والأسفل، واليسار، واليمين حول محيطها.

لإجراء اختبار الشد أحادي المحور. يتم تثبيت عينة حلقية على ماسكي سلكين رفيعين. يتم تمديد الماسكين حتى يتم تطبيق حمل تمزق قدره 5 mN على الحلقة.

بعد ذلك، أدخل مساحة المقطع العرضي المحسوبة من قياسات السماكة وسجل طول القياس. قم بإجراء دورات تمهيدية للحلقة ثماني مرات بين حمل التمزق و 50 kilo pascal. طبق الإجهاد بمعدل 10 millimeters per minute، وبعد الدورة التمهيدية الثامنة، اسحب العينة حتى الفشل بمعدل 10 millimeters per minute.

لكل حلقة، قم بقياس إجهاد الشد الأقصى وانفعال الفشل واحسب معامل المماس الأقصى من البيانات المكتسبة. بالإضافة إلى الدراسات الوظيفية في المختبر، يمكن لهذه الحلقات الخلوية الحية أن تندمج لتشكل أنابيب نسيجية. استخدم مقصاً جراحياً لقص نهايات أنابيب السيليكون بزاوية لإنشاء حواف مشطوفة، ثم قم بتعقيم أنابيب السيليكون باستخدام الموصدة (autoclave) أثناء عملية التعقيم.

املأ طبق بتري بالوسط الغذائي، وانقل حاملات الأنابيب المصنوعة من السيليكون المخصصة والمعقمة إلى كابينة السلامة الحيوية وضعها في طبق بتري فارغ. بعد ذلك، قم بإزالة الحلقات من آبار aros وضعها في طبق بتري المليء بالوسط الغذائي. ضع أنابيب السيليكون في طبق بتري نفسه لترطيبها قبل الاستخدام.

استخدم الملقط لوضع طرف أنبوب سيليكون في مركز الحلقة، ثم مرر الحلقة برفق فوق أنبوب السيليكون. حرك الحلقات حتى تتلامس عن طريق دفعها برفق وبشكل متتابع في كلا الاتجاهين على طول الأنبوب. بمجرد تركيب الحلقات، قم بمحاذاة أنابيب السيليكون داخل الحوامل المصنوعة من البولي كربونات واربط جزأي الحامل معاً.

أضف 55 milliliters من الوسط الغذائي إلى طبق بتري. استبدل الوسط الغذائي كل ثلاثة أيام طوال فترة الاستزراع لإزالة أنابيب الأنسجة. أولاً، املأ طبق بتري بمحلول PBS.

بعد ذلك، قم بتحرير أنابيب السيليكون من الحامل المصنوع من البولي كربونات واستخدم الملقط لسحب أنابيب الأنسجة من فوق أنبوب السيليكون ووضعها في الطبق. عند تنفيذ ذلك بشكل صحيح، تستقر الخلايا في قاع آبار aros وتنكمش خلال 24 ساعة من التثبيت لتكوين حلقة نسيجية حول العمود المركزي في بئر Agarro s؛ هذا رسم بياني تمثيلي لمنحنى الإجهاد والانفعال الذي تم الحصول عليه من اختبار شد أحادي المحور لحلقة نسيجية بمقاس 2 mm تم تكوينها من خلايا العضلات الملساء للجرذ. ومن ثم تُستخدم قيم مقاومة الشد القصوى، ومعامل الشد الأقصى، وقيم انفعال الكسر لمقارنة الخواص الميكانيكية لعينات الحلقات النسيجية التي نمت تحت معاملات زراعة مختلفة.

يمكن التحكم في الخواص الميكانيكية للحلقات النسيجية عن طريق تغيير معايير الزراعة، بما في ذلك عدد الخلايا المستقرة، ومدة الزراعة، ووسط الزراعة، ونوع الخلايا المستخدمة. وبالإضافة إلى خلايا العضلات الملساء في الجرذان، فإن خلايا العضلات الملساء البشرية الأولية تشكل حلقات نسيجية ذات قوة شد مماثلة.

تتجمع الخلايا الجذعية الميزنشيمية البشرية أيضاً لتشكيل حلقات، ولكنها لم تكن قوية بما يكفي لإجراء الاختبارات الميكانيكية. يتيح نظامنا تصنيع بنى نسيجية مهندسة بالكامل من الخلايا ببساطة عن طريق استزراع الخلايا في آبار aros المخصصة لدينا. وبمجرد تشغيل قالب البوليكربونات الأولي، يمكننا صنع عدد غير محدود من قوالب PDMS التي يمكن استخدامها بعد ذلك لصنع القوالب، وبالتالي لا يلزم توفر أي معدات إضافية.

يتميز هذا النظام بتعدد استخداماته، حيث استخدمنا عدة أنواع مختلفة من الخلايا في النظام لتكوين حلقات نسيجية، وبذلك يمكن استخدام هذا النظام كإمكانية محتملة في تطبيقات هندسة الأنسجة، وكذلك في الدراسات المختبرية (in vitro) لبحث مساهمات الخلايا والمصفوفة خارج الخلوية في بنية النسيج ووظيفته.