Activités de surveillance kinase et la phosphatase dans le cycle cellulaire par Ratiométrique FRET

Dans cette vidéo, les activités des kinases et des phosphatases sont surveillées tout au long du cycle cellulaire à l'aide du transfert d'énergie par résonance de Förster, ou FRET. Ici, une sonde d'activité de la kinase semblable à la polo, ou PLK1, comporte une protéine fluorescente cyan (CFP) placée à une extrémité et une protéine fluorescente jaune (YFP) placée à l'autre extrémité. Cette sonde est transfectée dans des cellules U2 OS.

Ensuite, afin d'examiner l'état de phosphorylation de la LK ciblée pendant la transition G2/M, les cellules U2 OS transfectées sont soumises à une imagerie fluorescente en lapse de temps. Lorsque CFP et YFP sont en proximité étroite et que CFP est excitée, l'énergie est transférée à YFP et l'émission de YFP peut être détectée. Toutefois, lorsque la sonde est phosphorylée, un changement conformationnel dans la protéine sépare CFP et YFP.

À présent, lorsque le CFP est excité, une émission forte du CFP et une émission faible seulement du YFP sont détectées. La quantification du rapport de l'émission du YFP après excitation du CFP et du YFP démontre que l'activité de PLK1 augmente en G2 et atteint un maximum durant la mitose. Ainsi, le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'imagerie cinématographique standard, réside dans le fait qu'une attention particulière est portée à ne pas perturber le cycle cellulaire, ni par les conditions d'imagerie ni par l'expression d'une sonde. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du cycle cellulaire, telles que le lieu et le moment où des kinases ou des phosphatases spécifiques sont activées.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les enzymes régulées par le cycle cellulaire, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes nécessitant des conditions non résolues, comme les tests de prolifération cellulaire. Pour surveiller le cycle cellulaire humain, les cellules U2 OS sont transfectées avec une sonde d'activité PK basée sur la fret. À l'aide d'une méthode de transfection standard au phosphate de calcium, les cellules sont sélectionnées dans la pur mycine pendant au moins sept jours.

Cela enrichit la population de cellules exprimant la sonde et limite le nombre de cellules présentant des niveaux d'expression toxiques ou des niveaux d'expression qui affectent gravement le cycle cellulaire. Les clones stables sont ensuite sélectionnés par dilution limitée ; l'expression de CFP et de YFP est ensuite examinée afin de vérifier qu'elles sont présentes dans toutes les cellules à un ratio approximativement identique. Si certaines cellules contiennent uniquement CFP ou YFP, une recombinaison s'est probablement produite ; dans ce cas, répétez la préparation du plasmide en utilisant des bactéries moins sujettes à la recombinaison homologue, telles que les cellules sure deux, puis linéarisez le plasmide et répétez la transfection.

Une fois que les cellules expriment de manière stable la sonde, semez-les dans des boîtes à fond en verre numéro 1,5 après qu'elles se soient attachées et qu'elles atteignent une confluence de 30 à 50 %. Changez le milieu pour un milieu indépendant du CO2 et ne contenant pas de rouge de phénol, puis montez les cellules sur un microscope à épifluorescence motorisé équipé d'un contrôle de température réglé à 37 degrés Celsius. Le microscope doit être équipé de filtres d'excitation et d'émission pour le CFP et le YFP.

Un miroir ROIC adapté à la surveillance du CFP et du YFP, et une lentille appropriée pour la résolution requise. Ici, une lentille à immersion dans l'air de 20 x NA 0,75 est utilisée. À l’aide de la lumière transmise, mettre les cellules au point.

Ne pas utiliser de lumière fluorescente à ce stade, car elle induirait une réponse au stress qui pourrait perturber le cycle cellulaire. Pour éviter la phototoxicité, régler la courbure au maximum disponible permettant la résolution subcellulaire requise. Pour cette expérience, il devrait être possible de distinguer le noyau et le cytoplasme.

Réglez un temps de pose court et insérez un filtre neutre de densité élevée. Ensuite, acquérez une image d'essai en 12 ou 16 bits en utilisant l'excitation et l'émission de YFP. Ajustez le temps de pose et les filtres neutres de densité afin que l'intensité moyenne dans une cellule soit approximativement égale à l'intensité du fond plus cinq fois la différence entre les intensités minimale et maximale du fond. Pour vérifier que les images ne sont pas saturées, examinez l'intensité de fluorescence de l'image de l'échantillon.

L'intensité maximale sur l'image doit être inférieure à la moitié de la plage dynamique afin de permettre la détection des différences d'intensité lorsque les cellules entrent en mitose. Ensuite, répétez ce processus en utilisant les filtres d'excitation CFP et d'émission YFP. Sélectionnez plusieurs régions contenant des cellules transfectées, en excluant les régions utilisées pour la mise au point et l'optimisation des conditions d'exposition.

Étant donné que ces procédures peuvent avoir déclenché une réponse au stress, assurez-vous que l'intensité maximale soit inférieure à la moitié de la plage dynamique dans toutes les cellules. Instruisez le logiciel d'acquérir deux images toutes les 45 minutes en utilisant l'excitation YFP, l'émission YFP et l'excitation CFP. Filtres d'émission YFP.

Réglez également la durée totale de l'expérience de manière à ce qu'elle dépasse celle du cycle cellulaire. Une fois tous les paramètres définis, commencez l'acquisition d'images ; après la fin de l'acquisition, ouvrez les images obtenues et mesurez la durée du cycle cellulaire d'une mitose à l'autre. Chez les cellules exprimant la sonde transfectée ici, la durée du cycle cellulaire était d'environ 20 à 25 heures.

Comparez cela aux données témoins pour le type cellulaire utilisé. Si la durée du cycle cellulaire correspond aux durées de référence, l'analyse FRET peut être effectuée. Une fois le chronométrage vérifié, les images peuvent être analysées.

L'analyse peut être réalisée par la plupart des logiciels dédiés à la microscopie. Ici, le logiciel gratuit Image J est utilisé avec le plugin Ratio Plus. Commencez l'analyse en ouvrant les images dans Image J. Si les images sont au format de pile multicolore, séparez les canaux individuels en les convertissant en une hyper-pile en sélectionnant image.

Ensuite, hyper-pile, puis pile vers hyper-pile. La fenêtre de conversion en hyper-pile s'ouvre avec les paramètres affichés ; cliquez sur OK. L'image sera désormais affichée avec deux barres de défilement situées en dessous.

Pour séparer ensuite les images en des piles monochromatiques, cliquez sur l'image et sélectionnez « réduire la dimensionnalité du hyper-stacking ». Une fenêtre de réduction s'ouvrira ; assurez-vous que les options « frames » et « conserver la source » sont sélectionnées. Cliquez ensuite sur « OK ».

Une nouvelle image contenant un seul canal apparaîtra. Répétez ce processus pour afficher une nouvelle image avec le second canal. Ensuite, afin d'améliorer la clarté visuelle des images finales, sélectionnez la pile d'excitation YFP et d'émission YFP.

Cliquez sur « process », puis sur « math ». Ensuite, multipliez. Lorsque la fenêtre de multiplication s'ouvre, entrez trois pour multiplier la pile d'émission YFP d'excitation YFP par trois. Cette étape est facultative et garantit que les rapports ne se situent pas dans l'intervalle entre zéro et un.

Ensuite, sur la barre d'outils de l'image J, sélectionnez l'outil de dessin à main levée. Puis, dans la pile d'excitation YFP, d'émission YFP, dessinez une région d'intérêt ou ROI dans une zone dépourvue de cellules, mais proche d'une cellule qui sera mesurée. Pour ajouter la ROI au gestionnaire de ROI, cliquez sur les outils d'analyse, puis sur Gestionnaire de ROI.

La fenêtre du gestionnaire de ROI apparaîtra. Cliquez sur « ajouter » pour enregistrer les coordonnées du ROI afin de mesurer l'intensité moyenne du ROI dans la pile d'images avec excitation YFP et émission YFP. Cliquez ensuite sur « analyser », puis sélectionnez « mesurer ».

La fenêtre des résultats s'ouvrira. Sélectionnez la pile d'excitation CFP et d'émission YFP. Ensuite, double-cliquez sur la ROI dans le gestionnaire de ROI et répétez la mesure.

La mesure est ajoutée à la fenêtre des résultats. Faites défiler d'autres positions dans la pile pour répéter ce processus à plusieurs points temporels. Vérifiez que les intensités de fond près de la cellule d'intérêt sont similaires tout au long du film en comparant les mesures dans la fenêtre des résultats.

Pour configurer les mesures afin d'inclure l'intensité minimale, cliquez sur analyser, puis sur configurer les mesures et indiquez la valeur de gris minimale et maximale. Une fenêtre affichant les options de mesure apparaîtra ensuite. Après avoir ajusté la luminosité et le contraste selon les besoins, dessinez une zone d'intérêt couvrant la majeure partie d'une cellule et mesurez l'intensité minimale dans les deux piles.

Ensuite, effectuez les mesures comme précédemment, en utilisant cette fois une cellule au lieu du fond. À l’aide des valeurs provenant des sections de résultats, calculez la différence entre l’intensité minimale mesurée et l’intens�té du fond, puis divisez-la par deux. Cela fournit une estimation initiale d’une valeur de seuil pour ouvrir le rapport plus sélectionner les greffons.

Ensuite, le ratio plus. Puis, pour le ratio FRET, sélectionnez la pile S d'excitation CFP et d'émission YFP, ou pour le ratio FRET inversé permettant de visualiser les sondes dont l'efficacité FRET diminue lors de la phosphorylation, sélectionnez la pile S d'excitation YFP et d'émission YFP afin d'insérer les intensités de fond mesurées ainsi que les valeurs de rognage.

Utilisez les valeurs provenant de la fenêtre de résultats et collez-les dans la fenêtre de rapport plus. Réglez la mise à l'échelle de la pile de rapports obtenue et appliquez une table de correspondance appropriée pour visualiser les variations de rapport. Des cellules U2 OS exprimant une sonde basée sur la fret surveillant l'activité de PLK un ont été filmées pendant 60 heures, comme décrit dans cette vidéo.

Cette image montre l'entrée cumulative en mitose de 50 cellules exprimant la sonde FRET, y compris les divisions des cellules filles. La majorité des cellules exprimant la sonde se divisent avec un temps de cycle cellulaire compris entre 20 et 25 heures, indiquant que les conditions d'observation et les niveaux d'expression de la sonde n'affectent pas la durée du cycle cellulaire. Une représentation en fausses couleurs du rapport FRET inversé, suivant une cellule au cours de quatre divisions, démontre que, bien qu'un bruit considérable soit présent, une tendance apparaît selon laquelle l'activité de la PK1 augmente en G2 et atteint un maximum pendant la mitose.

Lorsque les données brutes sont filtrées par moyenne et présentées sous forme de graphique, il est facile d'estimer le temps entre les pics d'activité. Cette figure montre la quantification du rapport FRET inversé de la cellule illustrée dans les images précédentes, extraite du graphique. Le moment de l'activation peut être estimé et, comme on peut le voir ici, la phosphorylation de la sonde devient visible environ quatre heures avant que celle-ci n'atteigne son maximum en mitose.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de maintenir les cellules dans un état non stressé, ce qui est assuré en minimisant l'exposition à la lumière ainsi que les variations de température ou de pH. Il est également important de garder à l'esprit que cette méthode permet de surveiller l'équilibre entre l'activité des kinases et celle des phosphatases dans une cellule. Cette procédure peut être combinée à des écrans d'interférence ARN ou d'inhibiteurs afin d'identifier les régulateurs en amont de ces kinases et phosphatases.