Determinazione dell'attività fagocitaria dei Campioni anticorpi clinici

Lo scopo del seguente esperimento è determinare l'attività fagocitaria di anticorpi antigene specifici in campioni clinici ad alto rendimento. Ciò si ottiene rivestendo prima le perle fluorescenti con un antigene di scelta per consentire la cattura della frazione antigene-specifica di anticorpi presenti in campioni di anticorpi clinici complessi. Come seconda fase fagocitica, le cellule TP 1 vengono incubate con le perle fluorescenti ionizzate, che poi fagocitano le perle in base al numero e alle caratteristiche del dominio FC degli anticorpi legati.

Successivamente, l'intensità della fluorescenza delle cellule THP one viene determinata mediante citometria a flusso su piastra ad alto rendimento al fine di quantificare l'attività fagocitaria degli anticorpi presenti nel campione. In definitiva, può essere valutata la capacità degli anticorpi antigene specifici nel campione di indurre la fagocitosi sulla base dell'assorbimento differenziale delle perle fluorescenti opsonize dovute alla variazione del titolo anticorpale o al riconoscimento variabile da parte dei recettori anticorpali espressi sulle cellule fagocitiche. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come quelli che utilizzano cellule fagocitiche primarie, sono l'aumento della produttività e il miglioramento della standardizzazione.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sull'immunologia di base della risposta immunitaria adattativa, ad esempio se diversi regimi vaccinali hanno indotto anticorpi con attività diverse. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle malattie infettive perché gli anticorpi danno un contributo importante all'attivazione di un'efficace risposta immunitaria protettiva. Sebbene abbiamo utilizzato questo metodo per fornire informazioni sull'attività degli anticorpi nell'infezione progressiva da HIV e nella vaccinazione, può essere applicato anche ad altri stati patologici come l'influenza, l'autoimmunità e la dengue, dove gli anticorpi frago possono esacerbare la malattia D piuttosto che fornire protezione.

Inizia diluendo l'antigene in un tampone che non contenga ammine primarie. Quindi sciogliere il sulfamidico NHS lc, reagente della biotina in acqua. Successivamente, aggiungere immediatamente il reagente idrato all'antigene e lasciare che la reazione proceda per un'ora a temperatura ambiente durante la miscelazione.

Occasionalmente, quando la reazione è completa, aggiungere il campione alla camera superiore di un'unità di concentrazione centrifuga per rimuovere l'eccesso di biotina non coniugata mediante scambio di tampone. Ora aggiungi PBS per portare il volume totale fino alla linea di riempimento di 15 millilitri. Infine, centrifugare il campione a 4.000 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius fino a quando il volume non viene ridotto a circa 1,5 millilitri.

Ripetendo questo passaggio tre volte per ottenere una rimozione quasi quantitativa della biotina libera. Dopo aver centrifugato 100 microlitri di perle di eut tradin fluorescenti da un micron in una microcentrifuga a 13.000 volte G per cinque minuti, risospendere e lavare le perle in un millilitro di 0,1% P-B-S-B-S-A seguendo la stessa procedura di centrifugazione. Quindi, dopo aver sospeso le perle lavate in 100 microlitri di P-B-S-B-S-A, di nuovo eloqua le perle in 10 tubi micro fued.

Quindi, combinare 10 microlitri della sospensione di perle lavate con concentrazioni variabili di antigene biotinilato nelle fasi di piegatura. Quindi incubare le sospensioni di perle e antigeni per una notte a quattro gradi Celsius in una provetta da microcentrifuga su un rotatore. Il giorno dopo.

Rimuovere l'antigene non legato lavando due volte le sospensioni con un millilitro di P-B-S-B-S-A e centrifugare i campioni ad alta velocità come prima fino a quando le perle non sono pellettate. Infine, Reese sospende le perle rivestite di antigene in un volume finale di un millilitro di P-B-S-B-S-A dopo aver purificato i campioni di anticorpi clinici dal plasma utilizzando un kit di purificazione IgG in gel di melone. Secondo le istruzioni del produttore, determinare la concentrazione degli anticorpi purificati mediante assorbanza a due 80.

Quindi diluire gli anticorpi a un milligrammo per millilitro in PBS, mettendo da parte i campioni anche per gli anticorpi di controllo monoclonale positivi e negativi. Quindi, risus, sospendere la soluzione di perle sature di antigene mediante vortice e quindi trasferire 10 microlitri di soluzione in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti a fondo rotondo fare attenzione ad agitare continuamente la sospensione del perlato per garantire che un numero uguale di perle fluorescenti venga aggiunto a ciascuno dei pozzetti. Creare una curva dose-risposta per ciascun anticorpo di controllo aggiungendo concentrazioni variabili degli anticorpi di interesse in volumi non superiori a 20 microlitri per ciascuno.

Bene, ora incuba i campioni di perle e anticorpi per due ore a 37 gradi Celsius per consentire agli anticorpi di legarsi alle perle subito prima che le perle siano finite. Incubazione: diluire un campione di cellule THP 1 a 2,5 volte 10 per cinque cellule per millilitro nel terreno. Quindi aggiungere 200 microlitri di cellule a ciascuno.

Infine, incubare le cellule con le perle rivestite di anticorpi durante la notte a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica in un incubatore fisso, consentendo alle cellule e alle perle di depositarsi per gravità. Il giorno successivo, rimuovere 100 microlitri di supinato da ogni pozzetto facendo attenzione a non disturbare il pellet cellulare. Fissare le cellule in 100 di para formaldeide al 4%, quindi pipettare per risospendere e mescolare le cellule.

Caricare ora la piastra sul lettore di piastre HTS di un citometro a flusso ad alta produttività, consentendo la raccolta automatizzata dei dati. L'intensità di fluorescenza di una cellula HTHP viene catturata e registrata. Questa intensità di fluorescenza viene quindi utilizzata per determinare il numero di perle fagocitate da ciascuna cellula, che definisce l'attività fagocitaria del campione di anticorpi da testare.

Dovrebbe esserci una chiara differenziazione dei campioni di anticorpi da soggetti affetti e non affetti. In questa figura. L'istogramma dei fatti di un campione di anticorpi proveniente da un soggetto HIV negativo rappresentato dalla Traccia Nera e da un soggetto HIV positivo rappresentato dalla traccia grigia, dimostrano l'aumento della fagocitosi guidato dalla presenza di anticorpi antigene-specifici.

La sensibilità ottimale di questo test dipende dalla saturazione delle microsfere con antigene biotinilato, come mostrato qui. Due microgrammi di antigene per microlitro di perle sono stati determinati come la concentrazione di saturazione per questo antigene. Questa curva dose-risposta dimostra la capacità differenziale dei campioni di anticorpi in questione di indurre la fagocitosi in un intervallo di concentrazione di anticorpi compreso tra 0,05 e cinque microgrammi per millilitro.

Questa fagocitosi differenziale può essere guidata da differenze nel titolo o nelle proprietà del dominio FC, come la sottoclasse IgG o lo stato di glicosilazione. Quando le cellule TP 1 vengono visualizzate al microscopio a fluorescenza, c'è una chiara evidenza di fagocitosi a sfere. Questa immagine fissa delle cellule TP 1 dopo l'incubazione con perle opsonizzate anticorpali in verde e perle non oporizzate in rosso dimostra la mancanza di captazione fagocitaria in assenza di anticorpi poiché solo le perle verdi erano cito dalle cellule TP uno.

Quando viene eseguita la microscopia time-lapse, l'assorbimento fagocitario anticorpale specifico delle perle fluorescenti è ancora più sorprendente. Le perle fluorescenti verdi che si vedono qui sono anticorpi ionizzati. Le perle fluorescenti rosse forniscono il controllo negativo Dopo questa procedura, possono essere eseguiti altri test della funzione anticorpale per rispondere a ulteriori domande sulle caratteristiche della risposta anticorpale all'infezione o alla vaccinazione.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come determinare l'attività fagocitaria dei campioni di anticorpi utilizzando la citometria a flusso oculare. Non dimenticare che lavorare con campioni clinici di sangue e plasma può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario adottare sempre precauzioni come indossare un'adeguata protezione personale e seguire procedure di manipolazione sicura.