构建用于递送负载干细胞的壳聚糖微球的胶原水凝胶

本方案提供了一种体外策略，通过将壳聚糖微球中的干细胞递送至胶原凝胶支架中进行收获与培养。首先，从原代脂肪干细胞中乳化并回收制备的壳聚糖微球。随后，将干细胞接种于壳聚糖微球上，并在孔径为八微米的膜插入式培养板中进行培养，以最终制备负载壳聚糖（CS）的壳聚糖微球（CSM），最后将微球递送系统与三维胶原凝胶支架混合。

最终，这种CSM系统在再生医学和药物递送领域具有潜在应用价值。与现有的细胞注射或微囊化等方法相比，该技术的主要优势在于细胞能够附着于载体材料，并在初始施用后持续存留。通常，初次使用该方法的研究人员可能会遇到困难，因为esan微球具有固有的静电荷。

在不扰动细胞的情况下，将细胞加载到微球层上会具有挑战性。切除并清洗包膜中的会阴和表皮脂肪组织，将组织切碎后，转移1至2克到含有1% FBS的25毫升HBSS中。离心后，收集漂浮的脂肪组织层至125毫升锥形瓶中。

加入25毫升II型胶原酶，并在旋转摇床上孵育反应。现在小心移除油层和脂肪层下方的液体部分，并依次通过170微米的尼龙网筛过滤。用25毫升洗涤液洗涤两次后，通过离心收集细胞。

HBSS重悬，将沉淀物悬浮于30毫升添加补充剂的MesenPro生长培养基中。将纯化的脂肪来源干细胞分装至两个T75培养瓶中，并在37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中扩增ASC制备物。该CSM方案是一种利用离子交联技术的水包油乳化过程。

将6毫升壳聚糖水溶液在100毫升油相混合物中，通过顶部搅拌和磁力搅拌同时反向搅拌一小时，形成稳定的水包油乳液；每15分钟加入1.5毫升1%的氢氧化钾正辛烷溶液，持续四小时。离子交联反应完成后，缓慢倾去油相，并立即将微球加入100毫升丙酮中。用丙酮洗涤微球，直至完全去除油相。

然后在真空条件下干燥回收的微球。使用粒径分析仪测定平均CSM颗粒大小、每毫克的表面积以及单位立方体积。用无菌水将CSM洗涤三次，以去除残留的盐分。

现在将CSM制备物用无水乙醇灭菌，用于50毫升玻璃试管中的细胞实验，将5毫克微球与1毫升0.5% TNBS溶液混合，在40摄氏度下孵育4小时。然后加入3毫升6摩尔/升盐酸，在60摄氏度下孵育2小时。将样品冷却至室温后，加入5毫升去离子水和10毫升乙醚。

为提取游离的TNBS，取5毫升水相等分试样，于水浴中加热至40摄氏度，保持15分钟，以蒸发残留的乙醚，随后冷却至室温。用分光光度计以15毫升水稀释样品。以TNBS作为空白对照，在345纳米处测定所制备的壳聚糖微球的吸光度。

同时测量用于制备CSM的壳聚糖用量。现在计算CSM中游离氨基数量相对于壳聚糖中总氨基数量的比例。将5 mg无菌CSM在无菌HBSS中室温平衡过夜。

将CSM转移至24孔培养板的8微米膜插件中。待CSM沉降后，小心吸除HBSS。然后向插件内加入300微升生长培养基，向插件外加入700微升生长培养基。重悬。

将脂肪来源的干细胞悬浮于 200 微升生长培养基中，并接种至培养板内的 CSM 上。在 37°C、5% 二氧化碳的湿化培养箱中孵育 24 小时。将带有干细胞的 CSM 转移至无菌微量离心管中，注意不要扰动已迁移至插入膜中的细胞。

现在去除残留的培养基，向每根试管中加入 250 µL 新鲜培养基。加入 25 µL 浓度为 5 mg/mL 的 MTT 溶液，孵育 4 小时。去除培养基，加入 250 µL 二甲基亚砜（DMSO），涡旋震荡以溶解甲臜复合物，然后将 CSM 在 2,700 ×g 离心 5 分钟。

使用630纳米作为参考波长，测定上清液在570纳米处的吸光度。随后根据已知数量的活A SC所获得的吸光度值，确定与CSM相关的细胞数量。将5毫克负载SC的CSM与7.5毫克/毫升的Ⅰ型胶原混合，该胶原提取自大鼠。

尾腱，使用2摩尔氢氧化钠调节pH至6.8，倒入培养板中。插入后立即转移至12孔板，孵育30分钟。在孵育期间每隔一天更换一次胶原A-S-C-C-S-M凝胶的培养基。

同时利用标准显微技术监测细胞从壳聚糖微球（CSM）向凝胶中的释放及迁移情况。以下示例描述了将脂肪来源干细胞从壳聚糖微球体外递送至胶原凝胶支架的策略。扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）图像显示所制备的壳聚糖微球具有均匀尺寸和多孔结构。

将微球与原代脂肪来源干细胞共孵育表明，每毫克 CSM 钙盐可负载 4,000 个细胞。SC 染色显示细胞在 CSM 表面铺展，并将伪足延伸至微球的多孔缝隙中。当将负载细胞的 CSM 与胶原凝胶混合后，细胞会迁移进入凝胶，并可随时间推移进行追踪观察。

该技术的意义立即延伸至大规模和慢性组织缺损的治疗。然而，由于该方法具有高度的通用性，可与多种用于治疗不同程度软组织和心肌组织缺损的细胞和/或生物材料相结合，因此这一治疗方案具有更广阔的应用前景。该方法有望为宿主细胞递送提供新的研究思路。

它还可应用于其他系统，例如注射剂、递送治疗药物，以及开发可同时递送细胞和治疗药物的杂合系统。