Isolamento e Expansão da Human Glioblastoma Multiforme Células Tumorais Utilizando o Ensaio Neurosphere

O objetivo deste protocolo é o isolamento e expansão de células tumorais multiformes de glioblastoma humano utilizando o ativo neurospheres. Isso é conseguido primeiro picando o tecido tumoral colhido, seguido pela dissociação mecânica da ização e, finalmente, plaqueando as células resultantes para crescer em cultura de neurosfera. Neste vídeo, mostraremos como isolar e expandir células-tronco do tecido tumoral de glioblastoma humano usando o método de cultura de neurosfera.

Este método também pode ser usado para cultivar células de outros tumores cerebrais, bem como tumores sólidos, como mama, próstata, fígado e pulmão. Ok, vamos começar. Depois de receber o tecido tumoral GBM ressecado da cirurgia, o meio é removido.

O tumor é lavado duas ou três vezes usando PBS estéril para remover contaminantes como sangue e detritos. Após a lavagem, coloque o tumor ressecado em uma placa de Petri estéril. Primeiro, corte o tumor em porções menores, depois transfira uma parte do tecido tumoral para uma placa de Petri separada, pique o tecido usando um bisturi número 10 em pedaços minúsculos.

Isso aumentará a área de superfície disponível para dissociação enzimática. A picagem pode levar de um a três minutos, dependendo do tamanho do tumor. Agora adicione três a cinco ml de tripsina pré-quente ao tecido picado e transfira-o para um tubo de falcão estéril de 15 ml.

Coloque o tubo de 15 ml em banho-maria a 37 graus por 10 a 15 minutos. Agite o tubo a cada cinco minutos. Para garantir uma melhor digestão do tecido, adicione um volume igual de inibidor de tripsina para interromper a reação.

A tripsina na ativação é segurada pipetando para cima e para baixo várias vezes. Centrifugue a suspensão a 800 RRP M ou 110 G por cinco minutos. Remova o sobrenadante e, em seguida, ressuspenda o palete em um ml de meio basal de células-tronco neuros, colocando a ponta contra o fundo do tubo.

Pipete para cima e para baixo de três a sete vezes para quebrar os aglomerados até obter uma suspensão leitosa sobre a pipetagem pode resultar em morte celular. Coloque um filtro de 40 mícrons em um tubo de 50 ml. Agora adicione 10 a 15 ml de meio basal à suspensão celular e misture, passe suavemente a suspensão celular pelo filtro de 40 mícrons para remover detritos em aglomerados não associados.

PT as células E aspire o supernat. Ressuspenda as células em um a dois ml de meio completo. Em seguida, pipete suavemente para cima e para baixo para homogeneizar a suspensão.

Misture 10 microlitros de suspensão celular em 90 microlitros de azul Trian. Misture bem a suspensão e transfira 10 microlitros para hemo. Citômetro. Execute uma contagem de células conforme mostrado aqui.

É necessária uma única suspensão celular sem aglomerados para ter uma contagem precisa de células. Não inclua células positivas azuis trianas. Ao contar para colocar as células em um balão T 80.

Adicione 20 ml de meio completo de células-tronco neuro a um tubo de 50 ml. Adicionar a quantidade adequada de suspensão celular até atingir uma densidade de 200 000 células por ml. Agora adicione EGF para atingir uma concentração final de 20 nanogramas por ml.

Adicione 0,2% de heparina na concentração de um microlitro por ml. Por fim, adicionar BFGF até atingir uma concentração final de 10 nanogramas por ml. Misture as células em meios completos suplementados com fatores de crescimento.

Bem, então transfira a suspensão para uma etiqueta T 80. O frasco então é transferido para a incubadora a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por sete a 10 dias. Após oito dias em cultura, as esferas estão totalmente crescidas e prontas para serem passadas.

Recolher o conteúdo do balão e transferir para uma centrífuga de 50 ml. As células a 800 RPM por cinco minutos. Aspirar o sobrenate e, em seguida, ressuspender a palete num ml de tripsina pré-quente.

Incubar as células em banho-maria a 37 graus Celsius por dois minutos. Adicione uma quantidade igual de inibidor de tripsina e misture bem para garantir uma ativação. Em seguida, pelotize as células.

Remova o supernat e ressuspenda as células em um ml de pipeta de meio completo para cima e para baixo suavemente para homogeneizar a suspensão celular. Efectuar uma contagem de células como descrito anteriormente para colocar as células num balão T 80 a 20 ml de meio completo num tubo de 50 ml. Adicionar uma quantidade adequada de suspensão celular até atingir uma densidade de 50 000 células por ml.

Agora adicione fatores de crescimento, incluindo EGF, BFF, GFF e heparina na concentração descrita anteriormente. Misture a suspensão celular resultante suavemente, depois transfira a suspensão para um T 80 e coloque na incubadora por sete a 10 dias. Aqui está um exemplo da cultura primária do GBM.

Após quatro dias nesta fase, você pode ver que as células estão proliferando e começando a formar esferas. Você não deve observar grandes aglomerados esféricos de células neste estágio. Isso teria resultado de uma preparação inadequada do tecido.

Depois de estar em cultura de sete a 10 dias, esferas de tamanhos variados se formaram quando as esferas atingiram um diâmetro médio de 150 a 200 mícrons, elas estão prontas para serem passadas. Este é um exemplo de cultura GBM de passagem após oito dias. Novamente, você pode ver as esferas de tamanhos variados, esferas saudáveis, exibindo micro picos em sua periferia.

Preparar uma suspensão de célula única é uma questão muito importante em qualquer cultura de esfera. Caso contrário, você pode acabar observando agregados de células mesmo no dia seguinte ao plaqueamento das células. Esses agregados devem ser assumidos como esferas, mas deve-se notar que leva pelo menos uma semana para que as células perfurantes formem esferas verdadeiras.

A quantidade de detritos na cultura da esfera do tumor primário varia dependendo de muitos fatores, como a origem do tecido e a precisão do tecido e também a técnica de processamento do tecido. Esperamos que você ache este vídeo útil e desejamos boa sorte em seus experimentos.