DII-Etichettatura di neuroni DRG per studiare Branching assonale in un monte intero Preparazione di Spinal Cord embrionali di topo

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare i modelli di ramificazione dei singoli assoni dei neuroni DRG in una preparazione dell'intera montatura del midollo spinale embrionale di topo. Al fine di identificare le molecole coinvolte nella ramificazione assonale, le proiezioni dei neuroni DRG nel midollo spinale del topo offrono un sistema sperimentale semplice, facile e accessibile per studiare la ramificazione assonale. Quando gli assoni ORL dei neuroni DRG raggiungono la zona di ingresso della radice dorsale del midollo, mostrano un modello stereotipato di biforcazione a forma di T o Y.

I due assoni figli risultanti procedono quindi in direzione rostrale o cordale, rispettivamente al margine laterale dorsale del cordone. Solo dopo un periodo di attesa da questi assoni staminali spuntano collaterali per penetrare la materia grigia e proiettare un neurone relè in un laminato specifico del midollo spinale dove avviene l'arborizzazione terminale. Questo video mostra innanzitutto come sezionare il midollo spinale.

Con il suo DRG attaccato da un topo embrionale al giorno 12,5 dopo la fissazione del campione, i minuscoli montaggi di dii vengono applicati al DRG utilizzando aghi di vetro estratti da tubi capillari Dopo una fase di incubazione, il midollo spinale marcato viene montato come una preparazione a libro aperto invertito per analizzare i singoli assoni utilizzando la microscopia a fluorescenza. La ramificazione degli assoni è un aspetto importante nello sviluppo della connettività neurale. Il metodo qui presentato consente un confronto dei modelli di ramificazione del tipo Y con quelli dei topi mutanti, e quindi consente l'identificazione delle molecole che regolano la ramificazione assonale.

Per prima cosa, impostare il microscopio da dissezione e disporre gli strumenti chirurgici necessari per la dissezione. Mettere un foglio di carta da filtro in una capsula di Petri rivestita di seta da 100 millimetri. Successivamente, versare il PBS freddo nei pozzetti di una piastra da 12 pozzetti, una piastra di Petri da 100 millimetri e una provetta da 12 millilitri e lasciare in ghiaccio.

Pipettare due millilitri di tampone di fissazione della paraldeide al 4% in ciascun pozzetto di una seconda piastra a 12 pozzetti e metterli sul ghiaccio. Dopo aver isolato le corna uterine bilaterali da un topo, trasferirle in un piatto da 100 millimetri con PBS ghiacciato. Dopo aver decapitato gli embrioni, trasferire i toci degli embrioni al 12.

Bene, impiattare, bagnare la carta da filtro nel piatto di protezione S con alcune gocce di PBS e posizionare un busto embrionale con il lato dorsale rivolto verso l'alto sulla carta per una migliore stabilità. Raddrizzare la coda e le estremità lontano dal corpo lavorando al microscopio da dissezione con un ingrandimento di circa 16 volte. Pizzica con cura la pelle dell'embrione sopra il midollo spinale con due paia di pinze a punta sottile iniziando dal centro.

Strappare delicatamente la pelle prima verso la coda, per poi riprendere dal centro verso il lato anteriore. Bagnare l'embrione di tanto in tanto con due o tre gocce di PBS per evitare che si secchi per assicurarsi che i gangli della radice dorsale o DRG non vengano strappati dal midollo spinale. Quando viene rimosso, staccare il DRG e il midollo spinale dalla colonna vertebrale cartilaginea circostante iniziando dal centro del lato destro dell'embrione e procedendo verso la coda, e poi verso l'estremità anteriore per staccare completamente il midollo spinale allentato dall'embrione.

Raccogli la sua parte cervicale con una pinza fine ed estraila in un unico pezzo verso il suo cordale. Fine. Immergere il midollo spinale isolato con il DRG attaccato in un pozzo. Dei 12 pozzetti la piastra riempita con tampone di fissazione, e procedere con la preparazione del midollo spinale dagli embrioni rimanenti.

Fissare il midollo spinale per almeno due ore sul ghiaccio per ogni corda in vinile da etichettare, preparare due aghi di vetro utilizzando un micro estrattore per pipette sotto controllo microscopico. Immergere la punta di ciascun ago di vetro da tre a cinque volte in una soluzione al 5% di colorante in etanolo per creare un sottile strato di cristalli di dai sull'ago, lavorando al microscopio da dissezione con un ingrandimento di circa 40 volte. Posiziona un midollo spinale con il lato ventrale rivolto verso l'alto su un vetrino usando le forbici a molla.

Aprire il cavo sul lato ventrale per tutta la sua lunghezza tagliando la piastra del pavimento per consentire il montaggio a libro aperto invertito. Posizionare il midollo spinale con il lato dorsale rivolto verso l'alto sul vetrino. Quindi avvicinarsi manualmente al midollo con la punta coperta di dai dell'ago di vetro e perforare con cura ogni secondo DRG su un lato del midollo spinale.

Quasi nessuna traccia di dai dovrebbe essere visibile nel DRG di perforazione per garantire l'etichettatura di solo un piccolo numero di neuroni utilizzando il secondo ago. Ripeti per l'altro lato del cavo, mirando solo ogni secondo. DRG evita una sovrapposizione di proiezioni assonali marcate da quelle vicine, il che potrebbe complicare la differenziazione dei singoli assoni.

Rimettere il midollo spinale nel tampone di fissazione e incubare al buio per almeno sei ore a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius per dare il tempo alla dieta di diffondersi lungo l'assone all'interno della membrana plasmatica. Dopo la diffusione della dieta, posizionare un singolo midollo spinale con il lato dorsale rivolto verso il basso su un vetrino coprioggetti in una goccia di PBS, aspirare il liquido in eccesso e appiattire il midollo in modalità a libro aperto invertito. Usando il forcipe.

Fare attenzione che i DRG collegati siano orientati correttamente lateralmente e non mescolare la preparazione su un vetrino da microscopio utilizzando PBS per evitare l'aumento di macchie di fondo indesiderate. L'analisi al microscopio a fluorescenza delle proiezioni assonali marcate deve essere eseguita il giorno del montaggio. Fino ad allora, mantieni i vetrini al buio a quattro gradi Celsius.

Qui, le viste dorsali di DRG marcato con Dai da topi wild type a ingrandimento crescente sono mostrate come descritto ogni secondo. DRG è stato etichettato da Dai. Qui, un piccolo numero di assoni viene marcato e, a un ingrandimento maggiore, la presenza di rami simili a T può essere identificata nella zona di ingresso della radice dorsale del midollo spinale.

Rami a forma di T. I singoli giri rostrali R o C cordali sono quantificati qui a diversi livelli vertebrali sia in topi carenti di peptide natriuretico di tipo C che in topi carenti di CMP. A E 13.5.

Il numero totale di neuroni contati è mostrato tra parentesi e la percentuale del tipo di traiettoria è mostrata di seguito. A differenza degli assoni wild type dei neuroni DRG nella CMP, i mutanti di segnalazione ruotano solo in una direzione invece di biforcarsi nella zona di ingresso della radice dorsale del midollo spinale. Questo metodo ci ha aiutato a identificare una cascata di segnalazione CGP che è essenziale per la biforcazione dell'incidente sensoriale come zona di ingresso della radice dorsale.

In contrasto con gli accenti di tipo selvaggio di cgm, il movimento di segnalazione P gira solo in una direzione invece di biforcarsi nella zona di ingresso della radice dors. Questi studi hanno anche rivelato che la coformazione non è influenzata nei mutanti di segnalazione CG P, indicando che il secondo tipo di ramificazione assonale osservato nei neuroni DGen è regolato in modo diverso.