Geração de Células T reguladoras induzidas a partir de células T humanas primárias Naïve e Memória

O objetivo geral deste procedimento é gerar células T reguladoras humanas a partir de células T primárias. Primeiro, as células mononucleares do sangue periférico são isoladas de amostras de sangue humano. As células T positivas para CD quatro são então purificadas da mistura de PBMC e cultivadas.

Após seis dias, as células são classificadas em efetor de memória ingênuo e subconjuntos de células T reguladoras induzidas usando um ensaio supressor de citômetro de fluxo realizado. O uso dessas células demonstra que esse método gera células T reguladoras humanas com atividade supressora. As principais vantagens desta técnica sobre aquelas que usam células bucais é que nosso método humano tem mais relevância fisiológica e clínica e permite a comparação de tregs com outras populações de células dentro de um único doador.

Eliminando a variabilidade interna do assunto. Este método pode responder a questões-chave sobre o campo celular regulador, como quais são os eventos regulatórios que modulam a transição entre as células T convencionais e as células reguladoras, ou quais são os eventos de sinalização e transcrição específicos das células reguladoras? As implicações dessa técnica se estendem às terapias de doenças autoimunes, condições de inflamação e câncer devido ao papel vital que ela desempenha na homeostase imunológica.

Geralmente, indivíduos novos nessa luta técnica por causa das técnicas de variedade usadas e, em algumas etapas, a janela estreita para condições ideais de cultura de células. Embora este método possa fornecer informações sobre o desenvolvimento de suas células, ele também pode ser usado para monitorar a plasticidade da diferenciação da linhagem de células T ou para analisar a capacidade do uso de células T para induzi-la ou preveni-la. Desenvolvimento de registro Demonstrando o procedimento estarão Andrea McCool e os alunos de pós-graduação Marie Catherine Ranier, Gavin Ellis e Catalina Vale Ortega.

Comece este procedimento isolando as células mononucleares do sangue periférico humano de 40 a 60 litros de revestimento B Buffy para diluir o revestimento buffy, transfira-o para uma garrafa de vidro autoclave de 500 mililitros contendo 150 mililitros de PBS estéril. Em seguida, adicione PBS mais estéril para aumentar o volume final para 250 mililitros. Em seguida, encha 10 tubos cônicos de 50 mililitros, cada um com 20 mililitros de solução de preparação para linfo.

Em seguida, cubra suavemente a solução de preparação Lympho com 25 mililitros da camada leucocitária diluída. Tomando cuidado para não perturbar a solução de preparação do linfo. Gire os tubos por 30 minutos em temperatura ambiente a 500 vezes G.Certifique-se de desligar a quebra da centrífuga para não perturbar a fração linfocítica.

Após a centrifugação, o PBM CS estará na interface entre a preparação linfográfica e as camadas do meio plasmático para coletá-los. Aspirar o meio plasmático até que cerca de um mililitro ainda cubra a camada de revestimento leucocitário que contém o pbmc. Use uma pipeta de 10 mililitros para transferir o pbmc para um novo tubo de 50 mililitros.

Depois de lavar as células duas vezes com PBS, suspenda-as novamente em 50 mililitros de RPMI frio e conte-as usando um hemocitômetro. A recuperação típica é de oito vezes 10 elevado a um a um vezes 10 elevado a nono p BMCs após a determinação da concentração. Resus suspende o PBM CS na concentração final de cinco vezes 10 elevado ao sétimo por mililitro em PBS contendo 2% de FBS e um EDTA milimolar transfere as células para um novo tubo de fundo redondo de polipropileno de 14 mililitros.

Em seguida, o kit de EAs será usado para selecionar negativamente as células de interesse. Os coquetéis de enriquecimento de células T fornecidos com o kit contêm um complexo de anticorpos tetraméricos, que possui um anticorpo anti-dextrina de um lado e um anticorpo contra antígenos indesejados da superfície celular do outro lado. Quando o coquetel é adicionado às células, o complexo de anticorpos tetramérica conecta as células indesejadas.

Partículas magnéticas revestidas com dextrano são então adicionadas, que se ligam ao complexo de anticorpos tetraméricas, conectando a célula indesejada à partícula magnética. Um ímã é então aplicado para separar as células indesejadas das células de interesse, que são então coletadas para isolar a pipeta de quatro células T T positivas uma vez 10 elevado ao oitavo a 4,25 vezes 10 elevado ao oitavo pbmc em um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, adicione 50 microlitros de CD humano, quatro coquetel de enriquecimento de células T positivas de anticorpos para cada mililitro de pbmc.

Misture e incube por 10 minutos em temperatura ambiente. Misture as partículas magnéticas para distribuí-las igualmente por toda a solução. Adicione 100 microlitros de partículas magnéticas para cada mililitro de pbmc.

Misture pipetando suavemente duas a três vezes e depois incube-os em temperatura ambiente por 10 minutos. Adicione PBS contendo FBS e EDTA para aumentar o volume para 10 mililitros por tubo misturado pipetando suavemente duas a três vezes. Em seguida, coloque o tubo sem tampa no ímã por cinco minutos com o tubo ainda no ímã.

Despeje o líquido em um novo tubo de 50 mililitros para isolar as células de interesse para melhor recuperação. Repita este processo adicionando P-B-S-F-B-S-E-D-T-A adicional à mistura do tubo e colocando a amostra de volta no ímã. Uma vez isoladas as células, conte-as e centrifugue a 500 vezes G por cinco minutos à temperatura ambiente.

Ressuspenda o pellet celular em meio de polarização para atingir uma concentração de duas vezes 10 elevado a seis células por mililitro. Em seguida, prossiga para a cultura conforme descrito na próxima seção do vídeo para induzir células T reguladoras. Pré-aqueça o anti CD três revestido seis, placas de cultura de tecidos bem a 37 graus Celsius.

Quando as placas estiverem quentes, aspire o PBS dos poços. Em seguida, adicione quatro mililitros da suspensão de quatro células enriquecidas positivas a cada um. Encha todos os poços vazios com PBS para reduzir a evaporação do meio incubado por três dias após a incubação.

Centrifugue a placa por cinco minutos a 500 vezes G. Em seguida, sem perturbar as células no fundo da placa, remova metade do meio e substitua por meio fresco incube por mais dois a três dias. As células agora podem ser classificadas por classificação de células ativadas por fluorescência, conforme descrito na próxima seção, ou usadas como células-alvo para um ensaio de supressão, conforme descrito posteriormente, após dois a três dias, as células e os controles de compensação apropriados são preparados para células ativadas por fluorescência. A classificação para separar células T induzidas e de memória reguladoras coram as células a serem classificadas com anti CD 25 pe, anti CD 45 RA PE SCI cinco e anti CD 1 27 A PC, conforme descrito no documento anexo.

Certifique-se também de adicionar anticorpos aos controles de compensação apropriados para análise de fax. Após a coloração, ressuspenda as células em uma concentração de uma vez 10 elevado a sete células por mililitro de tampão de lavagem, adicione 1,5 microlitros de DNAs, dois por mililitro de células, e filtre as células através de um filtro de células de náilon de 40 mícrons. Transfira as células para tubos de polipropileno de fundo redondo de cinco mililitros com não mais de 3,5 mililitros por tubo.

Resus suspende as células de controle de compensação em 300 microlitros de tampão de lavagem. Defina a compensação no citômetro de fluxo para minimizar a detecção cruzada pelos filtros PE A PC e PE sci-fi. Defina portões para classificar as células T virgens e de memória em cinco mililitros de tubos de poliestireno de fundo redondo contendo um mililitro de soro de bezerro recém-nascido para avaliar se as células T reguladoras geradas durante a classificação são capazes de suprimir a proliferação de células T.

Um ensaio de supressão é realizado aqui. As células enriquecidas positivas CD quatro não classificadas funcionarão como células-alvo. Estes não devem conter células T reguladoras induzidas positivas para CD 25.

Comece rotulando as células-alvo com CFSE usando um kit de rastreamento de células de acordo com as instruções do fabricante usando um microlitro de solução estoque de cinco molares por mililitro de células em vez de dois microlitros. Em seguida, um número de grânulos de inspetor de supressão de treg igual ao número total de células por centrifugação rápida em tubo de microcentrífuga. Lave as contas uma vez com RPMI e regue a pelota após a centrifugação.

Aspire o RPMI e suspenda-o novamente à concentração apropriada em meio de ensaio de supressão de oito microlitros por poço para uma placa de cultura de tecidos de fundo redondo de 96 poços. Adicione células-alvo coradas com CFSE de oito microlitros. Inspecione grânulos e células classificadas polarizadas até um volume final de ensaio de supressão recente.

Média de 200 microlitros. Todas as condições são revestidas em triplicado. Para preparar os controles, adicione 100 microlitros de células coradas com CFSE, oito microlitros de esferas de inspetor e uma vez 10 elevado ao quinto de células frescas não coradas no ensaio supressor de 92 microlitros.

Médio por poço para os dois primeiros poços de controle. Em seguida, adicione 100 microlitros de células coradas com CFSE e uma vez 10 ao quinto de células frescas não coradas em um ensaio supressor de 92 microlitros. Médio por poço para os dois segundos poços de controle.

Cubra a placa com papel alumínio e coloque-a na incubadora por cinco dias no escuro. Colete as células de cada poço pipetando e coloque-as em um tubo de poliestireno de fundo redondo de cinco mililitros. Centrifugue as células a 500 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Aspirar médio e reus suspendê-los e 300 microlitros de buffer de lavagem de fax frio. Para monitorar o progresso da diferenciação de células T reguladoras induzidas, CD primário humano purificado, quatro células T positivas para CD 25 negativas foram cultivadas em alíquotas de meio IT reg tomadas no dia 0, 1, 3 e cinco foram testadas por citometria de fluxo para avaliar a expressão dos marcadores CD 45 ra, Fox P três, CTLA quatro e CD 25, como pode ser visto nesses gráficos de pontos pseudocoloridos ao longo de um curso de cinco dias, as células proliferam e diferenciar in vitro em resposta à reticulação de CD três na presença de TGF beta e IL dois, levando a um perfil de CD 45 RA negativo FOX P três alto CTLA quatro alto e CD 25 alto. Isso indica o desenvolvimento de tregs induzidos a partir de precursores convencionais de células T para avaliar a capacidade relativa dos tregs gerados de suprimir a proliferação de células T.

As células marcadas com CFSE foram cultivadas com grânulos de inspetor de supressão de treg na presença de memória ingênua classificada e células I treg, como pode ser visto neste histograma. Células CD 25 altas, CD 45 RA negativas CD 1 27 negativas. As células T reguladoras de baixa indução são o único subconjunto de uma cultura de cinco dias que adquiriu capacidade de supressão regulatória.

Isso indica que as células geradas neste sistema são fenotípica e funcionalmente supressoras de células T reguladoras, em vez de células T convencionais ativadas, que podem expressar transitoriamente FOX P três e CD 25, mas não são imunossupressoras. A presença de células T reguladoras induzidas abole completamente a proliferação de células T CD quatro positivas. Os números são indicativos da porcentagem de células marcadas com CFSC que sofreram divisão para determinar que o mesmo vale para subconjuntos purificados de células T.

As células T primárias virgens e de memória humanas foram coradas com CFSE e cultivadas nela. Meio Treg após cinco dias, as células foram fenotipadas e as taxas de divisão celular foram estimadas conforme visto. Aqui, os tregs foram induzidos a partir de um pool de células T ingênuas e um pool de células T de memória após cinco dias de cultivo.

No meio de registro de TI padrão, CFSE. A coloração das células iniciais mostra que as células T virgens ou de memória se diferenciam das células T reguladoras somente após várias rodadas de divisão celular, os perfis comparativos de coloração CFSE identificam as células T reguladoras induzidas como as células mais proliferativas durante a cultura de cinco dias. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como obter TX induzido de uma população de memória ingênua ou células T inteiras obtidas de um único doador ao tentar este procedimento.

É importante manter a técnica estéril durante todo o processo e evitar a exposição do CFSE à luz após este procedimento. Outros métodos, como ensaios funcionais, podem ser realizados para responder a outras perguntas, como quais são as diferenças nas taxas de divisão celular, síntese de citocinas específicas e uso de canais iônicos entre células T reguladoras e convencionais após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da imunologia explorarem doenças autoimunes e outros patologistas relacionados a treg em pacientes humanos.

Não se esqueça de que trabalhar com sangue humano é extremamente perigoso e precauções como testes adequados para bancos de sangue e descarte adequado devem sempre ser usadas ao fazer esse procedimento.