HCVの制限要因を発見するヘテロカリオンの形成の2つの方法

この手順の目的は、任意の細胞株におけるC型肝炎ウイルスの複製サイクルの完了に対する制限因子の影響を調査することであり、最初の方法としてはheca形成に依存する2つの方法を使用して、ヒト肝細胞を培養することから始まり、次にC型肝炎ウイルスまたはH-C-V-R-N-Aをエレクトロポレーションによって肝細胞にトランスフェクションするAおよびHep 56 1Dパッケージング細胞を修復します。続いて、HCV複製細胞株をポリエチレングリコールにより、第2の融合法でそれぞれのパッケージング細胞株にfsedした。最初のステップは、高力価のHCVストックの生産です。

その後、異なる細胞株を共培養し、プロトタイプの泡沫状ウイルス糖タンパク質のトランスフェクションによって細胞融合を誘導します。次に、ヘテロカロンをHCVに感染させます。ヘテロキャリオン形成のいずれの方法にも続いて、蛍光顕微鏡法を実施して融合を確認し、感染性粒子の産生を定量化します。

この手法の主な利点は、HV特異的な優性制限因子の発現について、細胞株と初代細胞の大規模なパネルをスクリーニングするのに有用であることです。この方法は、HCVの種特異性と命名に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、ポリエチレングリコールによる細胞融合の誘導に先立って、2つの融合システムの基礎となる概念の理解を促進するために重要です。

HUH 7.5細胞を標準プロトコルに従ってH-C-V-R-N-Aでトランスフェクションし、翌日に摂氏37度、二酸化炭素5%で24時間培養します。サブゲノムレプリコンを保有するトランスフェクトされたHUH 7.5細胞をハーベストし、ヒールRおよびヘリウム56の1Dパッケージング細胞を採取します。これらのパッケージング細胞は、HCVタンパク質をECOタンパク質のコアE1、E2、P7、およびNS2をトリプス化した後、細胞懸濁液を以下の濃度に希釈してDMEM完全培地に再懸濁し、1000リットルあたり5細胞に10倍5倍、HEP56の1D細胞を1ミリリットルあたり5細胞に2倍10に回復させるように遺伝子操作された。

次に、ウェルごとに2〜3枚の滅菌ガラスカバースリップを備えた6ウェル培養プレートを調製します。融合効率をさらに解析するには、トランスフェクションしたHUH 7.5細胞1ミリリットルとパッケージング細胞1ミリリットルを組み合わせ、シードを6ウェルプレートの1ウェルにインキュベートし、摂氏37度、二酸化炭素5%で24時間後に24時間インキュベートします。セル密度を確認します。

細胞密度は、細胞融合の誘導前に60〜80%coの流暢さの範囲にする必要があります 細胞膜が細胞膜に近接して融合し、共培養細胞からの吸引培地を融合し、1ミリリットルのPBSで1回洗浄します。次に、予め温めた40%ポリエチレングリコールまたはPEG 1, 500の500マイクロリットルを慎重に追加します。コントロールとして共培養細胞の別のウェルに500マイクロリットルのPBSを加え、摂氏37度で5分間インキュベートしてヘテロキャリオン形成を誘導し、吸引PEGを誘導し、1分後に2ミリリットルのPBSを慎重に追加し、PBSを吸引し、PBSで2ミリリットルの新鮮なPBSウォッシュをPBS3で5回、1回の洗浄につき1分間、余分なPEGを除去する。

最後に、2ミリリットルのDMEMを各ウェルに完全な培地に加え、摂氏37度と二酸化炭素5%で48時間インキュベートします。各SNATを収集し、0.45ミクロンフィルターでろ過した後、細胞培養SNAT融合効率は、免疫蛍光法により決定でき、ガラスカバースリップを含むウェルを1ミリリットルのPBSで1分間スリップします。

PBS中の600マイクロリットルの3%パラアルデヒドで細胞を15分間固定します。最終洗浄後、1回の洗浄につき1分間、PBSで3回洗浄します。鉗子を使用して、カバースリップをPBS中の0.5%Triton X 100の500マイクロリットルを含む24ウェルプレート透過性細胞に5分間慎重に移します。

続いてPBSで3回洗浄し、それぞれに250マイクロリットルの一次抗体溶液を塗布する。抗NS five a抗体は0.5μg/ミリリットル、ヒトモノクローナル抗E 2抗体は6.4ナノグラム/ミリリットルの濃度としてよく使用します。45分後に室温で45分間インキュベートし、PBSで3回洗浄します。

次に、250マイクロリットルの二次抗体を各ウェルに添加し、二次ヤギ抗マウスまたはアレクサフロア5 46またはアレクサフロア4 88に結合した抗ヒトIgG特異的抗体を1ミリリットルあたり2マイクログラムの濃度として使用します。30分後に暗所で室温で30分間インキュベートします。PBSで一度洗ってください。

続いて、PBSで1〜3000に希釈した250マイクロリットルのDPIで細胞核を染色します。暗所で室温で1分間インキュベートし、PBSで4回、水で1回洗浄します。最後に、マウントカバーを顕微鏡スライド上の植物相の滴の上に逆さまに滑り込ませ、暗闇で乾燥させます。

この手順を開始するには、次の細胞の単一細胞懸濁液を回収して調製します。CD 81の内因性発現を欠くLuna NAヒト肝細胞株。ヒトCD81を安定して発現するHerパッケージング細胞とHep 56 1D細胞は、He r細胞と1対1の割合で、Hep 56 1D HCD 81細胞と1対2の割合でLuna n細胞を共培養し、12個あたり5個の細胞に対して10の1.5倍の総細胞密度をもたらす。

翌日、摂氏37度と二酸化炭素5%で24時間インキュベートします。製造元の指示に従って、脂肪切除術2000を使用して、FU遺伝子の強いPFEエンベロープタンパク質で細胞を一過性にトランスフェクションします。PFE糖タンパク質によるトランスフェクションの30時間後、MOIが約2.3のMOIで、事前に調製したウイルスストック350マイクロリットルをヘテロカロンに接種します。

翌朝、摂氏37度と二酸化炭素5%で12時間インキュベートします。PBSで一度洗浄し、ウェルごとに1ミリリットルのDMEM完全培地を加え、摂氏37度で48時間インキュベートし、48時間後に5%二酸化炭素でインキュベートし、ヘテロカリオン培養物の仰臥位を収穫し、0.45ミクロンのフィルターで仰臥位をろ過します。次に、前日に96ウェルプレートに播種したHUH 7.5細胞を、前日に限定希釈アッセイで播種したHUH 7.5細胞に接種し、72時間インキュベートしてから感染性子孫粒子の産生を定量化します。

融合イベントを視覚化する手順は、共培養の6時間前に完了し、付着細胞を5ミリリットルのPBSで1回洗浄し、その後、10センチメートルのディッシュあたり4ミリリットルの適切なDI溶液を添加し、細胞を摂氏37度で45分間インキュベートし、細胞を5ミリリットルのPBSで1分間洗浄し、5%二酸化炭素を洗浄し、DMEMを添加し、摂氏37度で6時間インキュベートします播種前に5%の二酸化炭素。その後、12ウェルプレートの各ウェルにカバースリップを添加し、そのシードとトランスフェクション染色細胞を前述したように。トランスフェクション後30時間で、細胞を1ミリリットルのPBSで1分間注意深く洗浄し、次いで250マイクロリットルの3%パラアルデヒドで室温で15分間細胞を固定します。

細胞を1ミリリットルのPBSで1分間洗浄し、その後、PBSで細胞を1回洗浄した後、1分間ダッピーで染色します PBSで1回、最初のアプローチでカバースリップ、サングラス、スライドで細胞を洗浄し、HCV複製サイクルの完了に対する制限因子の影響を調査します。ヘテロカロンでは、HUH 7.5細胞を最初にルシフェラーゼ導入遺伝子とHCV非構造タンパク質を発現するサブゲノムレプリコンを一過性にトランスフェクションし、次に共培養してHCV構造タンパク質、コアタンパク質、アクセサリータンパク質を発現する細胞株に融合させました。代表的な結果は、この図に示されている細胞またはE2構造タンパク質およびNS5A非構造タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いた免疫染色

上のパネルの画像は、MS 5、A、Dの両方のPEGシグナルで処理すると、同じ細胞質で2つが同時に検出され、自己融合を示していることを示しています。対照的に、下のパネルのは、共培養細胞をPBSで処理した場合、融合が誘導されなかったことを示しています。したがって、ヘテロカロンから産生されるウイルス感染性を定量化するためのシグナルの共局在は観察されず、融合誘導後48時間で共培養物からスネットを採取し、その後のルシフェラーゼアッセイのためにナイーブHUH 7.5細胞を接種するために使用しました。

このグラフでは、3つの独立した実験のミーム値が表示されています。灰色の水平バーは、感染していないHUH 7.5細胞で測定された相対光単位またはRLUの背景を表しています。特に、HUH 7.5レプリカント細胞をナイーブ細胞株と融合させるか、またはコントロールとしてPBSで処理した場合、培養液中に感染性は検出されませんでした。

しかし、PEGによってHUH 7.5レプリコン細胞株とパッケージング細胞株との間の細胞融合が誘導されると、感染性ウイルス粒子が培養液中に放出されました。これは、ウイルス産生には細胞融合とパッケージング細胞株でのウイルスタンパク質の発現が必要であることを示しており、HUH 7.5ヒト肝細胞のヘテロカロンだけでなく、ヒト非生細胞およびマウス肝細胞のヘテロカロンもウイルスの放出を可能にし、これらの細胞タイプにおける可能な制限因子によってアセンブリと放出が支配的に阻害されないことを示しています。別のアプローチでは、細胞の培養後に遺伝子性糖タンパク質を発現させることにより、体細胞融合を誘導しました。

ヘテロカロンは、共培養前にセルトラッカー色素で別々の細胞株を染色することにより可視化し、トランスフェクションの30時間後に遺伝子タンパク質細胞を固定してDPIで染色し、代表的な結果をこの図に示します。2つの細胞型の融合は、ここに示すように、細胞質内に均一に分布した色素を持つヘテロキャリーオンによって示されます。対照的に、下のパネルの画像は、細胞融合がないことを示す二重染色細胞質を持つ細胞の不在を示しています。

この最終グラフは、すべてのHCVエントリー因子が、ヒトCD81を発現するhelaまたはHep 56 1D細胞を持つLuna N細胞のヘテロキャリアでのみ発現することを示しています。ここでは、培養物に感染性HCV粒子を接種しました。培養液を48時間後に収集し、ヘテロカロンからのde novo粒子放出を、ナイーブなHUH 7.5標的細胞を用いた限界希釈アッセイによって決定しました。3つの独立した実験の平均値が示され、灰色の水平バーはアッセイの検出限界を表しています。

対照として、Aは月のN細胞と月のN細胞と融合し、その結果、検出限界に近い感染性HCVのレベルが非常に低かった。月のN細胞をナイーブなHEP 56 1D細胞と融合させた場合も同様の結果が得られました。いずれの場合も、ヒトCD81は存在しなかったため、HCVはヘテロスに生産的に感染することができなかった。

対照的に、測定の背景から約10倍上の感染性ウイルス子孫のde novo産生は、HEERを用いた月10細胞ビューおよびヒトCD81を発現するHEP 56 1D細胞と融合した月手細胞で観察された。これは、HCVがRetroCarsで複製サイクルを成功裏に完了したことを示しており、したがって、これらの細胞株における主要な制限因子の発現が除外されています。マスターすると、適切に実行されれば、完全な実験手順を1週間で完了できます。

このビデオを見た後、HV制限因子の可能性を特定するためのヘテロキャリーオンを生成する方法について十分に理解しているはずです。C型肝炎ウイルスの取り扱いは非常に危険であり、この手順を実行する際には、高いバイオセーフティなどの予防措置を常に考慮する必要があることを忘れないでください。