גידול והזרקה של Manduca סקסטה זחלים להערכה ארסית קטריאלי

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך פתוגניות חיידקית כנגד זחלי חרקים באמצעות מנדוקה סקה כאורגניזם מודל. זה מושג על ידי גידול זחלי החרקים מביצים מעוקרות לשלב ההתפתחות הרביעי. בשלב השני מכינים את דגימות החיידקים להזרקה.

לאחר מכן, החיידקים מוזרקים לזחלי המנדוקה סקה הרביעית. בשלב האחרון, מותם של החרקים לאורך זמן לאחר ההזרקה עוקבים. בסופו של דבר, הזמן עד למוות של חרקים נרשם ומשמש להערכת אלימות חיידקים.

שיטה זו יכולה לסייע בטיפול בהיבטים מרכזיים בתחום הסימביוזה, כולל גילוי פתוגנים חדשים של חרקים וקביעת הבדלים באלימות בין מיני חיידקים או זנים. התחל בחיטוי ראשון, 15 גרם מקדחה ב-900 עד 1000 מיליליטר מים. מיד לאחר חיטוי.

מערבבים את המקדחה עם 166 גרם דיאטת נבט חיטה. בבלנדר מעבדה יוצקים את דיאטת החרקים המעורבת לתבשיל. כשהוא מקורר, העבירו את הדיאטה מהמנה לחתיכת נייר אלומיניום.

עוטפים אותו היטב ושומרים אותו בארבע מעלות צלזיוס. עם ההגעה, הנח את מין M לביצים במחזיק מסנן זכוכית ומנגנון בקבוק ואקום עם נייר סינון 90 מילימטר. לאחר מכן שפכו 250 מיליליטר של תמיסת אקונומיקה של 0.6% על הביצים למשך שתיים-שלוש דקות, תוך ערבוב מדי פעם.

כעת הפעל את הוואקום כדי לנקז את תמיסת האקונומיקה, ואז שטוף את הביצים המעוקרות שלוש עד ארבע פעמים עם 250 מיליליטר מים מזוקקים סטריליים לכל שטיפה. לאחר מכן, הניחו פיסת נייר סינון טרייה בגודל 90 מילימטר למכסה צלחת פטרי, ולאחר מכן העבירו את הביצים לנייר הסינון כדי לאפשר להן להתייבש במכסה המנוע עד שהן כבר לא נדבקות זו לזו. כעת הניחו את דיאטת החרקים שהוכנה לאחרונה על גבי פקק גומי מאובטח בכמה מיכלי פלסטיק והעבירו כ-40 ביצים לכל מיכל, תוך הפרדת הביצים מהתזונה כדי למנוע זיהום פטרייתי הנגרם על ידי לחות.

שמרו על הביצים בטמפרטורה של 26 מעלות צלזיוס עם אור של 16 שעות ותקופת צילום חשוכה של שמונה שעות. הביצים יתבהרו לצבע לבן צהוב לפני הבקיעה בסיום הבקיעה. בעזרת מלקחיים כדי לאסוף כל אחד מהזחלים על ידי הקרן השחורה הארוכה, העבירו בזהירות כ -25 זחלים כל אחד למיכלים חדשים עם תזונה בתחתית.

דגרו על הזחלים במשך יומיים באותם תנאים כמו הביצים, בעוד שמוות של זחלים הוא חריג בשלב זה, ניתן להבחין בכמה זחלים מתים או בעלי סיכוי גבוה יותר לעיכוב התפתחותי. כעת, העבירו את הזחלים למיכלים בודדים עם חתיכות מזון קטנות כדי להימנע מהתנהגויות קניבליסטיות ודגרו אותם שוב. החליפו את המזון ונקו את הצואה מהמיכלים כל יומיים עד שהחרקים עוברים את התכת הזחל השלישית.

התכת הזחל השלישית היא שלב הזחל הרביעי המאופיין בהופעת קרס שחור דמוי מסרגות על כל פרולה ובבולטות מוגברת של הפסים לאורך גוף החרק. לאחר גידול זני החיידקים הרצויים לבדיקה, סובב 500 מיקרוליטר כל אחד מזני החיידקים למשך שתי דקות במיקרו צנטריפוגה פי 17,000, G בטמפרטורת החדר. לאחר מכן שטפו את הכדורים במיליליטר אחד של PBS סטרילי באותם תנאים.

לאחר החייאת התאים בחצי מיליליטר נוסף של PBS סטרילי, מדדו את הצפיפות האופטית של התרחיפים לפני תחילת ההזרקות באמצעות קצה פיפטה טרי לכל דילול, הכינו שישה דילולים סדרתיים פי עשרה של זן החיידקים הראשון ב-PBS סטרילי בצלחת מיקרוטיטר של 96 בארות. כעת אתר 10 מיקרוליטר כל אחד של דילול, 10 למינוס שתיים עד 10 למינוס שש לאורך החלק העליון של צלחת פטרי המכילה את מצע הגידול המתאים. ואז הטה את הצלחת כך שהכתמים יתפשטו למרכז.

לאחר מכן, לאחר הסרת תזונת החרקים והצואה, הניחו את מיכלי החרקים על קרח למשך כחמש דקות בזמן שהחרקים מתקררים. שטפו מחט מזרק שלוש פעמים כל אחת בשתי שפופרות של 70 עד 100% אתנול, ולאחר מכן שפופרת אחת של מים סטריליים. לאחר מכן השתמש בציטומטר המו כדי לכמת את תרחיפי התאים המדוללים תחת מיקרוסקופ.

בהתאם לחיסון הרצוי, שאב 10 מיקרוליטר מהמיקרוטיטר המתאים. ובכן אז ספוג את פני החרק להזרקה עם 95% אתנול. הכי קשה להחזיק את החרק במצב המתאים להזרקה, תוך מניפולציה של המחט והקפדה לא לנקב את מעי החרק.

כמו כן, הקפידו לעבוד במהירות כדי שהחרק לא יתחמם ויתחיל להתפתל בזמן שאתם מחזיקים אותו להזרקה. הזרקו את תרחיף התאים של 10 מיקרוליטר לתוך החרק בזווית של פחות מ-45 מעלות מאחורי אחת מרגלי הבטן. הקפידו לא לנקב את המעיים, הזריקו את התוכן ממש מתחת לשכבת האפידרמיס.

לאחר הזרקת כל חרק עם זן החיידקים הראשון, שוב, צלחו את ה-10 למינוס שתיים עד 10 עד מינוס שש דילולים הפעם לאמצע הצלחת. תן להם לזרום לכיוון תחתית הצלחת. כעת דגרו את הצלחות בטמפרטורה המתאימה, ולאחר מכן ספרו את המושבות כדי לספור את החיסון.

לאחר חזרה על תהליך הדילול, הציפוי וההזרקה עבור כל זן חיידקים, הזרקו שלושה עד חמישה חרקים עם PBS סטרילי לקבוצת הביקורת השלילית. לאחר מכן דגרו על כל החרקים בטמפרטורה של 26 מעלות צלזיוס ותקופת הצילום החשוכה של 16 שעות אור ושמונה שעות. לבסוף, עקוב אחר הישרדות החרקים לאורך זמן לאחר הזריקות, החרקים מציגים לעתים קרובות אובדן תיאבון, שלשול מימי, צהוב, צואה או אובדן מים במהלך ההדבקה לפני המוות.

מוות חרקים מאופיין כחוסר תנועה רצונית בעת גירוי. בבדיקה זו, הוזרקו לחרקים כ-50 יחידות יוצרות מושבה מסוג בר או זן מוטנטי מוחלש של Xer Haus NLA נאנק עד אמצע שלב העץ. החרקים נצפו במשך כ-72 שעות ואחוז החרקים שהוזרקו שעדיין היו בחיים בכל נקודת זמן נרשם.

בניסוי זה, הזן המוחלש הראה עיכוב ברור בהרג חרקים, בעוד שהזן מסוג הבר הרג את כל ששת הזחלים תוך 30 שעות לאחר ההזרקה לפני מותו של כל אחד מהזחלים הנגועים במוטציה. הנתונים נבדלים סטטיסטית בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כגון מיצוי RNA ותגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת על מנת לענות על שאלות נוספות כגון קביעה אם החיידק מסוגל לתמרן את התגובה החיסונית של החרקים או לא.