在Live哺乳动物细胞中质粒复制多代荧光显微镜监测

该程序的总体目标是观察分裂细胞中病毒基因组的分配。这是通过首先制备可以通过荧光显微镜观察的质粒来实现的。第二步是将质粒引入分裂细胞中，然后用编码乳糖阻遏物的逆转录病毒或与荧光蛋白融合的紫胶眼感染细胞。

乳糖阻遏蛋白融合蛋白将特异性结合质粒亚中的乳糖纵子序列。通过荧光显微镜监测细胞，以在多个细胞周期中追踪单个质粒。最终，对获取的图像进行处理，以确定病毒基因组如何在分裂细胞中维持。

与定量 PCR Southern 印迹或荧光原位杂交等现有方法相比，该技术的主要优点是该技术允许在多个时间点观察单个质粒。为了能够通过荧光显微镜观察质粒，使用标准分子克隆技术将包含大约 250 个乳糖纵子序列或 LAC O 拷贝的 DNA 片段引入质粒中。在这个例子中，质粒是大约 170 kb 对的后中，包含 cap's 肉瘤相关疱疹病毒或 KSHV 的整个基因组，并编码对潮霉素的耐药性。

通过转染将含有 LAC O 的质粒 DNA 引入 hela 和 SLK 哺乳动物细胞中 在 60 毫米培养皿中，将细胞与 10 微克纯化质粒、25 微升 DNA、脂质切除术、2000 个 0.5 毫升、Optum 和 3.5 毫升一起孵育。DMEM 四小时。将培养基更换为含 10% 胎牛血清的 DMEM，让细胞恢复 48 小时。

随后将转染的细胞以低密度铺板在大培养皿中，并在含有 10% 胎牛血清和 300 μg/mL 潮霉素的 DMEM 中培养三周，以选择引入的质粒，使用无菌片段和浸泡的滤纸将潮霉素抗性菌落转移到新的培养皿中。一到两周后，当转染的克隆生长以填充培养皿时，将培养皿放入培养箱中，分离 DNA 进行限制性消化和 Southern 印迹，以确保 LAC O 质粒的聚合物是均一的并且具有预期的大小。该印迹示例显示克隆 1 中的 LAC O 聚合物是均相的，并且与阳性对照的 LAC O 聚合物相同。

在泳道 7 中，如果质粒未被设计为表达乳糖抑制因子 lac eye 的融合，则用编码 lac eye 与红色荧光蛋白（如 lac eye、TD 番茄、TD 番茄）融合的逆转录病毒感染合适的克隆，而不是荧光更接近绿色的蛋白质，以最大限度地减少因长时间多次暴露而发生的光毒性。引入 LAC 眼融合蛋白后，在 200 μg/ml IPTG 存在下培养细胞，以阻止融合蛋白结合 DNA。该程序最关键的方面之一是获得具有适当荧光强度的克隆。

应筛选大量克隆以识别具有最佳荧光培养的克隆。细胞至少三天以允许表达 LAC 眼 TD 番茄蛋白筛选克隆，以达到最佳 lac 眼、TD 番茄显示不同信号且未结合融合蛋白背景水平最低的克隆，然后对表达 LAC I TD 番茄的细胞进行成像，将它们以小于 10% 汇合度的密度接种在 35 毫米玻璃底培养皿中。这将允许成对的细胞分裂成 8 到 16 个细胞的菌落，而不会在成像开始前 1 到 3 小时重叠。

用同时缺乏选择性药物和 IPTG 的培养基冲洗板 3 次。这会洗掉无活力的细胞，并允许 lac 眼融合蛋白结合质粒中的 LAC 细胞。用 2 毫升替换培养基，用 10% 胎牛血清和 25 毫摩尔嬉皮士孵育 1 到 3 小时，然后在成像前用在安装环中拉伸的培养箔替换培养皿的顶部，用于 35 毫米培养皿。

这种覆盖物会抑制培养基的蒸发，随着时间的推移，盐浓度会增加并杀死细胞。本实验中使用的成像系统由一台蔡司 Axio 200 M 倒置显微镜组成，该显微镜配备了电动载物台和用于灵敏检测信号的 EM CCD 相机。荧光激发光由 Collibra 系统的中性白光 LED 提供。

成像系统由软件控制，用于使用多个 Z 堆栈在长时间间隔内自动采集图像。载物台顶部培养箱用于将细胞保持在 37 摄氏度、5% 至 10% 二氧化碳的加湿室中。对油物镜使用加热套环，以防止物镜虹吸。

样品产生的热量为系统提供了足够的时间来达到稳定的温度。为了最大限度地减少实验过程中的运动伪影，成像系统应位于空气台上，以与振动隔离。要开始可视化标记的 DNA 的过程，请使用 DIC 成像来观察细胞并确定每个视野中细胞顶部和底部的焦平面，移动到从细胞顶部向下大约三分之一的焦平面，保存 x， y，已保存舞台位置列表中的 Z 坐标。

这些保存的位置中的每一个都将是 Zack 图像的中心，以在显微镜控制软件中捕获细胞，定义在每个保存的载物台位置要执行的 Zack 图像，定义足够的切片，以便捕获整个细胞以及细胞所在平面上方和下方的额外切片。选择 0.35 到 0.50 微米的 Z 步长，以允许在 Z 维度上进行近似奈奎斯特采样。这些切片允许在细胞周期中跟踪细胞运动进行检测，也用于图像堆栈的采集后处理。

这将产生 40 到 60 张图像的堆栈，具体取决于单元格的厚度。定义一个时间序列实验，以每隔 30 分钟收集一次 Zacks 的明场图像，每隔 10 到 60 分钟收集一次荧光图像。在实验过程中不要使用 DIC 成像，因为它需要比标准明场成像更多的光，而标准明场成像会在长时间实验过程中不必要地使细胞暴露于光毒性。

开始软件对照实验。确保系统在实验过程中不受干扰。获取实验的所有图像后，查看每个 Zack 的图像，并按时间点裁剪掉图像中任何不需要的区域，以减少计算机处理时间。

在下一步中，将信号强度重新分配给每个 Z 堆栈中的原点像素。在 Axio 视觉软件中使用基于成像系统测得的点扩散函数的反卷积算法。解卷积的结果如下所示。

检查图像以跟踪细胞周期期间质粒的强度变化和移动以及质粒到子细胞的分配。这些通过计算制作的图像包括不同信号所在的多个 Z 平面，表明表达 LAC 眼 TD 番茄的 HELOC 细胞的细胞核由于融合蛋白上的核定位信号而发出荧光，将其定位到细胞核。在没有 I-P-T-G-K-S-H-V 的情况下，编码 LAC O 序列的基因组募集了许多荧光蛋白拷贝，并在细胞核的背景强度上作为明亮的信号脱颖而出。

相反，在 IPTG 存在下，LAC 眼荧光蛋白被阻止与其识别缺乏 O 序列结合，Zack 的最大强度投射在 5 个时间获得一个细胞周期。此图显示了代表性实验中的点。图 A 中可见的细胞中荧光标记的病毒基因组在图 B 中合成，然后在细胞分裂过程中将病毒基因组分配给子细胞，如图 C、D 和 E 所示，健康 HELOC 细胞的细胞周期大约需要 24 小时，子细胞通常彼此靠近，并在下一个细胞周期中同时继续分裂。

使用此协议，可以在尝试此过程时跟踪细胞中的病毒基因组多代。重要的是要记住在生成时观察细胞形态，以确保细胞在整个实验过程中保持健康。