Electroencefalografía simultánea, en tiempo real Medición de la concentración de lactato y Manipulación optogenético de la actividad neuronal en la corteza cerebral de roedores

El objetivo general de este procedimiento es medir el sueño definido por EEG y la concentración de lactato durante la estimulación optogenética en coordenadas estereotáxicas precisas. Implantar quirúrgicamente los cables electroencefalográficos y las cánulas necesarias para un sensor de lactato y un cable de fibra óptica. A continuación, inserte el cable de fibra óptica y el sensor de lactato precalibrado en sus cánulas guía en el cráneo del animal.

A continuación, ajuste la intensidad del estímulo de luz azul para lograr la respuesta electrofisiológica deseada. A continuación, se procede a recoger los datos electroencefalográficos, electromiográficos y de concentración de lactato mientras se permite al animal comportarse y/o dormir espontáneamente. En comparación con otros métodos, como los estudios farmacológicos del EEG, este enfoque experimental tiene la ventaja de monitorear la bioquímica y la electrofisiología del cerebro, mientras que la actividad de las neuronas se manipula en tiempo real en una escala de tiempo de menos de un segundo.

Por lo tanto, el potencial para producir nuevos conocimientos para el campo de la investigación del sueño es alto. Por ejemplo, se pueden identificar los concomitantes metabólicos y electrofisiológicos del sueño de ondas lentas. Este tipo de experimento también se puede aplicar en otras áreas de la neurociencia, como el aprendizaje y la memoria, la plasticidad sináptica o los trastornos convulsivos.

La técnica quirúrgica es técnicamente desafiante. Requiere una buena dosis de destreza, pero eso se puede lograr con la práctica. En esta demostración visual, repetiré los pasos críticos de algunos procedimientos quirúrgicos complicados que complementarán la descripción escrita.

Una vez que un animal se ha recuperado de la cirugía, el desafío es insertar correctamente el sensor de lactato y el cable de fibra óptica. Jonathan y yo demostraremos cómo usar una mano firme al sujetar al animal para insertar estas dos delicadas piezas de equipo. Por último, mostraremos cómo optimizar la respuesta del EEG ajustando la intensidad del estímulo en tiempo real.

Para este experimento, se utilizaron ratones transgénicos que expresan el canal catiónico sensible a la luz azul. El canal se adopta en dos en las neuronas corticales cerebrales. Primero anestesiar al ratón usando 5% de flúor, 95% de oxígeno para la inducción mientras se mantiene la anestesia con 3% de flúor, 97% de oxígeno.

Haga una incisión medial en la parte superior del cráneo desde entre los ojos hasta la parte posterior del cráneo. Limpie el cráneo con peróxido de hidrógeno y solución salina estéril. Localice y marque B y Lambda para determinar las coordenadas estereotáxicas para las configuraciones de estímulos optogenéticos de electrodos, orificios de tornillo principales con un taladro dental de alta velocidad con una broca de bola de 0,5 milímetros seguida de una broca de bola de 0,7 milímetros.

Inserte los tornillos de kelo gram del electrodo en los orificios con un destornillador manual plano. Conduzca en aproximadamente cuatro a cinco revoluciones para obtener la profundidad deseada. Sostenga las cánulas guía en su lugar con una cánula estereotáxica y luego fíjelas al cráneo y a los anclajes con cemento acrílico Para mantener la permeabilidad, cada cánula guía debe contener una cánula o estilete ficticio desde el momento de la cirugía hasta el momento de la experimentación.

Una vez que los electroencefalogramas y las cánulas guía estén colocados en el cráneo, únalos con una capa delgada de cemento acrílico dental. Después de que el cemento se endureca, coloque el conector de plástico sobre el montículo de cemento seco vendido en los extremos de los cables que emanan de los cables de EEG a los contactos del conector de plástico en caso de que el cable conduzca en cemento. A continuación, pase los cables del electromiograma a través de los músculos del núcleo deslizándolos en el cilindro de una aguja de calibre 21.

Perforado a través del músculo, ata un nudo de cirujano doble, una sutura de nailon de cinco ceros alrededor de estos alambres, justo distal a donde salen de la sutura muscular, volviendo a juntar la piel que se retrajo para acceder al tejido muscular con nudos de cirujano interrumpidos usando una sutura de nailon P de corte inverso, tres agujas y cinco suturas de nailon cero. Una vez que la unidad de estímulo mc esté programada, ejecútela como un generador de señales independiente como una señal binaria de encendido y apagado de cinco voltios. Conecte la unidad de estímulo mc a la unidad de potencia habilitada para TTL del láser con conectores BNC.

Conecte la unidad de potencia láser al láser a través de un cable plano. Conecte también el láser al conector FC macho del cable de conexión de fibra óptica de origen. Conecte el cable de fibra óptica de origen a la junta giratoria.

Conmutador La junta rotativa de fibra óptica sirve como conmutador. A medida que el animal se mueve por su jaula, la junta giratoria gira para evitar la rotura de los cables de fibra óptica debido al par de rotación. Con bridas de plástico, fije el conmutador a un soporte metálico colocado encima de la jaula cilíndrica en la que se aloja el animal.

Sujete el mouse usando una mano para sujetar el mouse debajo de una palma ahuecada. Orienta la cabeza entre el dedo medio y el dedo índice del experimentador. Ahora limpie la cánula guía de escombros y desechos con una aguja estéril de calibre 25.

A continuación, inserte el cable de fibra óptica con la mano y fíjelo a la cánula de guía de fibra óptica con un tapón de rosca roscado. Controle la profundidad de inserción del cable de fibra óptica en el cerebro mediante un nudo de sutura atado en el cable de fibra óptica a una distancia fija del extremo plano cortado. El sensor se equipara en solución salina tamponada con fosfato y se expone a tres concentraciones de lactato de L de forma escalonada.

Según los protocolos del fabricante, inserte el sensor precalibrado en la cánula guía de lactato montada en el cráneo de una manera idéntica al procedimiento de inserción del cable de fibra óptica. Conecte el sensor de lactato al preamplificador del biosensor pinnacle 8, 400 con conectores bipolares. A continuación, conecte este preamplificador al conector de ocho pines del soporte de cabeza implantado quirúrgicamente.

Antes de recopilar datos, use la perilla de control de intensidad del láser para ajustar la intensidad del estímulo optogenético. La amplitud de la respuesta EEG variará entre los animales debido a factores que no se han estudiado sistemáticamente. Por lo tanto, es necesario ajustar la intensidad del estímulo optogenético y verificar que la respuesta EEG es adecuada cuando se logra la respuesta deseada.

Recopile datos utilizando el sistema Pinnacle 8, 400 con la puntuación neurológica. Una interfaz SEIA clasifica los estados de sueño mediante la inspección visual del proceso de datos de EEG y EMG. Los datos en épocas de diez segundos como vigilia sin movimiento ocular rápido, sueño o sueño con movimiento ocular rápido basado en el EEG y EMG.

Esta configuración de estímulo optogenético biosensor muestra los electrodos de EEG implantados quirúrgicamente, el sensor de lactato y la cánula para la estimulación optogenética. En ausencia de estimulación optogenética, este ratón se sometió a un sueño espontáneo. Las transiciones del estado de vigilia mientras E-E-G-E-M-G y la concentración de lactato cerebral se monitorizaron continuamente durante la vigilia y los dos subtipos de sueño.

El movimiento ocular rápido y el movimiento ocular no rápido se definen en función del EEG y el EMG. Curiosamente, la corriente del biosensor de lactato aumenta en función del EEG de baja amplitud y disminuye en función del EEG de alta amplitud. Ambos canales del EEG responden a los estímulos optogenéticos emitidos en la corteza frontal.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo implantar quirúrgicamente un ratón para la manipulación optogenética simultánea y la medición del electroencefalograma, el electromiograma y la concentración de lactato en el cerebro. Una vez dominada, esta técnica quirúrgica se puede realizar correctamente en 90 a 120 minutos. Recuerde monitorear constantemente la respiración del animal como un indicador de la profundidad de la anestesia.

Si el animal respira con menos frecuencia que una vez cada cuatro o cinco segundos, la anestesia puede ser demasiado profunda. Si el animal respira con más frecuencia que una vez cada dos segundos, la anestesia puede ser demasiado ligera. Recuerde tomar las precauciones de seguridad adecuadas cuando utilice el agente anestésico gaseoso es de flúor.

Asegúrese de que haya una ventilación adecuada en el quirófano para proteger su retina del láser utilizado para la estimulación optogenética. Use gafas protectoras o encierre al animal en un gabinete a prueba de luz. Querrá practicar la implantación del biosensor de lactato y el cable de fibra óptica en un ratón completamente despierto.

Los ratones no cumplen con estos procedimientos y deben ser inmovilizados. Sin embargo, la sujeción no puede ser tan fuerte como para lesionar al animal o impedir la respiración.